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shiyiyaya金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
克隆失敗原因：NdeI+KpnI？ 已有4人參與
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現(xiàn)有: 15K質(zhì)粒pA，NdeI+KpnI雙酶切之后產(chǎn)生11K+4K（回收11K做載體）； 6.7K質(zhì)粒pB，NdeI+KpnI雙酶切之后產(chǎn)生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）; 連接回收的11K和4K。 結(jié)果失敗：經(jīng)多種方案鑒定，轉(zhuǎn)化長(zhǎng)出來(lái)的重組子都是質(zhì)粒pB. 我已經(jīng)嘗試單酶切*2次、PCR擴(kuò)增4K片段，重新轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，挑單克隆再繼續(xù)…都不行。感覺(jué)就像pB沒(méi)有切干凈。 請(qǐng)問(wèn)蟲(chóng)友，可否遇到類似情況？NdeI+KpnI，這兩個(gè)酶的活性就是低嗎？ 謝謝幫忙！ |
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shiyiyaya
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9樓2014-03-06 08:17:29
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| 酶切的話，不存在那種酶的酶活性問(wèn)題，有的只是不同廠家的酶質(zhì)量問(wèn)題，另外存放等影響因素。當(dāng)然操作時(shí)添加適當(dāng)?shù)牧恳彩窍喈?dāng)重要的。我覺(jué)得你說(shuō)說(shuō)你的酶切和連接具體操作會(huì)有助于大家對(duì)你進(jìn)行分析。 |
2樓2014-03-05 20:19:38
lvbobo823
鐵桿木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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| 建議你換換新酶分別酶切，每次酶切跑個(gè)膠看看有沒(méi)有切完全，轉(zhuǎn)化時(shí)加一個(gè)酶切對(duì)照看看有沒(méi)有菌生長(zhǎng)，沒(méi)長(zhǎng)說(shuō)明切完全，長(zhǎng)了但比連接產(chǎn)物少很多表明還可以挑選出陽(yáng)性菌。 |
3樓2014-03-05 20:54:57
shiyiyaya
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4樓2014-03-05 22:53:08
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