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jianlanyou銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
堿裂解法提取質(zhì)粒中為什么要冰浴？ 已有3人參與
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如題，堿法提取質(zhì)粒中溶液一和溶液三為什么要冰��？ 求回答全面細(xì)致精準(zhǔn)。 我知道現(xiàn)在有專門做這個(gè)的試劑盒，但我是要參加研究生復(fù)試，不知道面試時(shí)會(huì)不會(huì)提問，所以冰浴的原理必須搞清楚。 |
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| 溶液III 的作用 溶液III 加入后就會(huì)有大量的沉淀，與SDS 的加入有關(guān)系。十二烷基硫酸鈉 （sodium dodecylsulfate）SDS 遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS 是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。溶液III 加入后的 沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了 SDS 中的鈉離子形成了不溶性的 PDS，而高濃度的 鹽，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸 上結(jié)合一個(gè) SDS 分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白 質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組 DNA 也一起被共沉淀了。這個(gè)過程 不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA 太長了，長長的DNA 自然容易被PDS 給共沉淀了， 盡管SDS 并不與DNA 分子結(jié)合。 2 M 的醋酸是為了中和NaOH，因?yàn)殚L時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，所以要 中和之�；蚪MDNA 一旦發(fā)生斷裂，只要是50－100 kb 大小的片斷，就沒有辦 5 法再被 PDS 共沉淀了。所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后 得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組 DNA 混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃 的總DNA 條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液III 加入后基因組DNA 無法快速復(fù)性就被 沉淀了，這是天大的誤會(huì)，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好，DNA 分子在中性溶液 中都是溶解的。NaOH 本來是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA 分子的變性其實(shí)是個(gè)副 產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實(shí)沒有關(guān)系。溶液III 加入并混合均勻后在冰上放 置，目的是為了PDS 沉淀更充分一點(diǎn)。 |
2樓2014-03-12 21:31:56
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
dllchina: 金幣+5, 鼓勵(lì)應(yīng)助，新蟲+5金幣 2014-03-12 23:11:36
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| 溶液III 的作用 溶液III 加入后就會(huì)有大量的沉淀，與SDS 的加入有關(guān)系。十二烷基硫酸鈉 （sodium dodecylsulfate）SDS 遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS 是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。溶液III 加入后的 沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了 SDS 中的鈉離子形成了不溶性的 PDS，而高濃度的 鹽，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸 上結(jié)合一個(gè) SDS 分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白 質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組 DNA 也一起被共沉淀了。這個(gè)過程 不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA 太長了，長長的DNA 自然容易被PDS 給共沉淀了， 盡管SDS 并不與DNA 分子結(jié)合。 2 M 的醋酸是為了中和NaOH，因?yàn)殚L時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，所以要 中和之。基因組DNA 一旦發(fā)生斷裂，只要是50－100 kb 大小的片斷，就沒有辦 5 法再被 PDS 共沉淀了。所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后 得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組 DNA 混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃 的總DNA 條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液III 加入后基因組DNA 無法快速復(fù)性就被 沉淀了，這是天大的誤會(huì)，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好，DNA 分子在中性溶液 中都是溶解的。NaOH 本來是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA 分子的變性其實(shí)是個(gè)副 產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實(shí)沒有關(guān)系。溶液III 加入并混合均勻后在冰上放 置，目的是為了PDS 沉淀更充分一點(diǎn)。 |
3樓2014-03-12 21:34:37
jianlanyou
銀蟲 (正式寫手)
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4樓2014-03-13 10:00:11
yinzheng
銅蟲 (小有名氣)
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5樓2014-05-11 22:47:51
Neo2000
木蟲 (著名寫手)
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6樓2014-05-11 23:07:19
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