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jianlanyou銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
堿裂解法提取質粒中為什么要冰��？ 已有3人參與
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如題，堿法提取質粒中溶液一和溶液三為什么要冰��？ 求回答全面細致精準。 我知道現(xiàn)在有專門做這個的試劑盒，但我是要參加研究生復試，不知道面試時會不會提問，所以冰浴的原理必須搞清楚。 |
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jianlanyou
銀蟲 (正式寫手)
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4樓2014-03-13 10:00:11
| 溶液III 的作用 溶液III 加入后就會有大量的沉淀，與SDS 的加入有關系。十二烷基硫酸鈉 （sodium dodecylsulfate）SDS 遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS 是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。溶液III 加入后的 沉淀實際上是鉀離子置換了 SDS 中的鈉離子形成了不溶性的 PDS，而高濃度的 鹽，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸 上結合一個 SDS 分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白 質沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組 DNA 也一起被共沉淀了。這個過程 不難想象，因為基因組DNA 太長了，長長的DNA 自然容易被PDS 給共沉淀了， 盡管SDS 并不與DNA 分子結合。 2 M 的醋酸是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要 中和之�；蚪MDNA 一旦發(fā)生斷裂，只要是50－100 kb 大小的片斷，就沒有辦 5 法再被 PDS 共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后 得到的質粒上總會有大量的基因組 DNA 混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃 的總DNA 條帶。很多人誤認為是溶液III 加入后基因組DNA 無法快速復性就被 沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復性的也好，DNA 分子在中性溶液 中都是溶解的。NaOH 本來是為了溶解細胞而用的，DNA 分子的變性其實是個副 產物，與它是不是沉淀下來其實沒有關系。溶液III 加入并混合均勻后在冰上放 置，目的是為了PDS 沉淀更充分一點。 |
2樓2014-03-12 21:31:56
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
dllchina: 金幣+5, 鼓勵應助，新蟲+5金幣 2014-03-12 23:11:36
感謝參與，應助指數(shù) +1
dllchina: 金幣+5, 鼓勵應助，新蟲+5金幣 2014-03-12 23:11:36
| 溶液III 的作用 溶液III 加入后就會有大量的沉淀，與SDS 的加入有關系。十二烷基硫酸鈉 （sodium dodecylsulfate）SDS 遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS 是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。溶液III 加入后的 沉淀實際上是鉀離子置換了 SDS 中的鈉離子形成了不溶性的 PDS，而高濃度的 鹽，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸 上結合一個 SDS 分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白 質沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組 DNA 也一起被共沉淀了。這個過程 不難想象，因為基因組DNA 太長了，長長的DNA 自然容易被PDS 給共沉淀了， 盡管SDS 并不與DNA 分子結合。 2 M 的醋酸是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要 中和之�；蚪MDNA 一旦發(fā)生斷裂，只要是50－100 kb 大小的片斷，就沒有辦 5 法再被 PDS 共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后 得到的質粒上總會有大量的基因組 DNA 混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃 的總DNA 條帶。很多人誤認為是溶液III 加入后基因組DNA 無法快速復性就被 沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復性的也好，DNA 分子在中性溶液 中都是溶解的。NaOH 本來是為了溶解細胞而用的，DNA 分子的變性其實是個副 產物，與它是不是沉淀下來其實沒有關系。溶液III 加入并混合均勻后在冰上放 置，目的是為了PDS 沉淀更充分一點。 |
3樓2014-03-12 21:34:37
yinzheng
銅蟲 (小有名氣)
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5樓2014-05-11 22:47:51
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