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大神幫忙看看原核表達的結(jié)果。。。咋這樣？ 已有2人參與
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最近一直在做原核表達，結(jié)果讓我都快瘋了。。。 我做的這個基因很多前輩做了發(fā)現(xiàn)結(jié)果都不表達。。。導師交給我，經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)目的基因有很多稀有密碼子氨基酸，隨之換Rosetta菌株，發(fā)現(xiàn)表達結(jié)果跟以前不一樣了！ 請看圖：左邊兩個相同的是不加誘導劑空白對照和空載對照，后面分別是不同IPTG濃度梯度，最后一條為Marker（質(zhì)量不好，第一條90KDa的，第二條60KDa）目的蛋白64KDa Q1：為什么加入誘導劑后，很多非目的蛋白集體邊稀了？（第四孔道樣品是在煮沸時進了水=_=，但是之前跑了幾塊的確都變稀了，所以應該不是溶液溶度被稀釋的問題） Q2：因為變得稀釋，我的目的蛋白是否表達了？（與對照相比，從上往下第三條亮帶，圖片上對照組下面是空白的，而加誘導劑后的有一條很細的帶，在一定誘導條件下有最大表達，當然 這都是我認為的） Q3：接上問，其實肉眼可以看到空白對照有一個在我的目的蛋白大小處，有很細的一條線，但是在凝膠成像系統(tǒng)上，熒光照后，照片結(jié)果也看不出來，這是怎么回事？因為這個原因，更覺著目的蛋白是否表達了。 求大神賜教。。。。。。 多謝~ IMG_20140314_140608.jpg |
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2樓2014-03-15 18:29:02
3樓2014-03-16 14:19:11
4樓2014-05-11 10:52:10
luwei13566
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【答案】應助回帖
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2014-05-12 09:34:03
CJNicolas: 金幣+4, ★有幫助, 感謝回復！ 2014-05-12 10:05:44
kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2014-05-12 09:34:03
CJNicolas: 金幣+4, ★有幫助, 感謝回復！ 2014-05-12 10:05:44
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Q1：左邊兩個對照你是怎么做的？菌體擴培后沒有加IPTG嗎？如果沒有加的話你的這兩個對照就不能用，因為你的對照的發(fā)酵條件和你的實驗菌株完全不一樣。 Q2：你先做好對照再來討論是否表達。~從圖上看沒有表達的概率很大。 Q3：同上~~如果成功表達了，目標處會很明顯的。建議你看看成功用Rosetta菌株表達的文獻，條件再摸索一下，真不行就得密碼子優(yōu)化了 |
5樓2014-05-11 13:38:47
6樓2014-05-12 10:05:20
luwei13566
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7樓2014-05-12 13:50:59
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8樓2014-05-12 19:31:21
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