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CJNicolas銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
大神幫忙看看原核表達(dá)的結(jié)果。。。咋這樣？ 已有2人參與
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最近一直在做原核表達(dá)，結(jié)果讓我都快瘋了。。。 我做的這個(gè)基因很多前輩做了發(fā)現(xiàn)結(jié)果都不表達(dá)。。。導(dǎo)師交給我，經(jīng)過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)目的基因有很多稀有密碼子氨基酸，隨之換Rosetta菌株，發(fā)現(xiàn)表達(dá)結(jié)果跟以前不一樣了！ 請(qǐng)看圖：左邊兩個(gè)相同的是不加誘導(dǎo)劑空白對(duì)照和空載對(duì)照，后面分別是不同IPTG濃度梯度，最后一條為Marker（質(zhì)量不好，第一條90KDa的，第二條60KDa）目的蛋白64KDa Q1：為什么加入誘導(dǎo)劑后，很多非目的蛋白集體邊稀了？（第四孔道樣品是在煮沸時(shí)進(jìn)了水=_=，但是之前跑了幾塊的確都變稀了，所以應(yīng)該不是溶液溶度被稀釋的問(wèn)題） Q2：因?yàn)樽兊孟♂�，我的目的蛋白是否表達(dá)了？（與對(duì)照相比，從上往下第三條亮帶，圖片上對(duì)照組下面是空白的，而加誘導(dǎo)劑后的有一條很細(xì)的帶，在一定誘導(dǎo)條件下有最大表達(dá)，當(dāng)然 這都是我認(rèn)為的） Q3：接上問(wèn)，其實(shí)肉眼可以看到空白對(duì)照有一個(gè)在我的目的蛋白大小處，有很細(xì)的一條線，但是在凝膠成像系統(tǒng)上，熒光照后，照片結(jié)果也看不出來(lái)，這是怎么回事？因?yàn)檫@個(gè)原因，更覺(jué)著目的蛋白是否表達(dá)了。 求大神賜教。。。。。。 多謝~ IMG_20140314_140608.jpg |
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4樓2014-05-11 10:52:10
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
CJNicolas: 金幣+3, ★有幫助, 至少有個(gè)懂的回答了一下我的疑惑，結(jié)果是沒(méi)表達(dá)。。。 2014-03-16 14:19:45
gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-03-31 19:01:18
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
CJNicolas: 金幣+3, ★有幫助, 至少有個(gè)懂的回答了一下我的疑惑，結(jié)果是沒(méi)表達(dá)。。。 2014-03-16 14:19:45
gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-03-31 19:01:18
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1)從圖上看，目的基因沒(méi)有得到成功表達(dá)； 2）可以設(shè)計(jì)融合蛋白進(jìn)行表達(dá)，再經(jīng)過(guò)純化濃縮后跑膠檢測(cè) 3）可以考慮密碼子優(yōu)化 |
2樓2014-03-15 18:29:02
CJNicolas
銀蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
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- 專業(yè): 生物化學(xué)
3樓2014-03-16 14:19:11
luwei13566
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-05-12 09:34:03
CJNicolas: 金幣+4, ★有幫助, 感謝回復(fù)！ 2014-05-12 10:05:44
kx444555: 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-05-12 09:34:03
CJNicolas: 金幣+4, ★有幫助, 感謝回復(fù)！ 2014-05-12 10:05:44
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Q1：左邊兩個(gè)對(duì)照你是怎么做的？菌體擴(kuò)培后沒(méi)有加IPTG嗎？如果沒(méi)有加的話你的這兩個(gè)對(duì)照就不能用，因?yàn)槟愕膶?duì)照的發(fā)酵條件和你的實(shí)驗(yàn)菌株完全不一樣。 Q2：你先做好對(duì)照再來(lái)討論是否表達(dá)。~從圖上看沒(méi)有表達(dá)的概率很大。 Q3：同上~~如果成功表達(dá)了，目標(biāo)處會(huì)很明顯的。建議你看看成功用Rosetta菌株表達(dá)的文獻(xiàn)，條件再摸索一下，真不行就得密碼子優(yōu)化了 |
5樓2014-05-11 13:38:47
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