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付情雪614新蟲 (初入文壇)
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[求助]
caco-2細(xì)胞的緊密連接蛋白的免疫熒光染色
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這是本人近期做出的免疫熒光，目的是測(cè)細(xì)胞之間的緊密連接蛋白。步驟如下： 吸凈培養(yǎng)液，用PBS沖洗5分鐘×2次 ，在室溫下用 3.7%的多聚甲醛固定 10min。然后清洗3遍。單層細(xì)胞用含 2%TX-100的 PBS 室溫下液孵育 15min，清洗3次。然后加2%的牛血清蛋白（BSA）和1%的吐溫-20封閉液常溫封閉30分鐘。再加1:300 的一抗：兔抗claudin-1，Claudin-5，于 4℃冰箱中孵育過夜，pbs洗3次。第二天用1:500的羊IgG-Alexa488抗兔，標(biāo)記2h 后，再洗3遍，利用激光共聚焦顯微鏡觀察。 不知道哪里不對(duì)，細(xì)胞在熒光觀察細(xì)胞上面有一層霧一樣的覆蓋物，但拍出的熒光照片還算清晰。不知道那層覆蓋物是什么？ 拍出的照片背景很重，有什么解決的辦法？細(xì)胞上還有很多洞洞，也不知道什么原因。。。 請(qǐng)高手指點(diǎn)！��！ 1.jpg 2.jpg |
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