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dingcong1216新蟲 (小有名氣)
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電泳圖引物條帶很亮，目的產(chǎn)物條帶不亮 已有6人參與
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PCR后跑電泳發(fā)現(xiàn)引物條帶很亮，目的產(chǎn)物條帶不亮。PCR程序為 94℃ 5min 94℃ 40S 52℃ 40S 72℃ 40S 38循環(huán) 72℃ 10min 4℃ 電泳120v 35min 最右邊的兩個是我的，右二為不加cDNA的對照，右一是加了模板的圖。 請各位大俠給點兒建議，怎樣優(yōu)化一下條件 dell 2014-03-26 11 時 50 分.jpg |
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dingcong1216
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2樓2014-03-26 16:11:36
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3樓2014-03-26 18:02:07
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目標(biāo)產(chǎn)物的亮度小，說明其量少，引物量說明引物量多，各人以為原因很多，一：引物與模板鏈的特異性不高，也就是說在延伸是只要一小部分能與模板結(jié)合，且引物的設(shè)計有問題。二：變性時出問題了，可能變性不完全。其次可以考慮體系中的離子強(qiáng)度，聚合酶特點，模板的熔點，平臺效應(yīng)，還有就是跑膠別太心急，低壓長時跑的條帶更漂亮。我也是剛解除pcr，有什么不對的地方，望諒解�。�！ [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
4樓2014-03-26 20:52:18
wangweijian
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可以從以下幾點考慮可能的問題所在： 首先，如果不是擴(kuò)增很長的片段，不需要38個循環(huán)這么長，一般30個循環(huán)就進(jìn)入平臺期了，32個循環(huán)足矣。 其次，如果是同源引物，體系中引物終濃度在0.2uM就行，引物多了反而有可能抑制結(jié)合延伸。 第三，若果是cDNA作為模版，最好采用熱啟動。 可用的解決辦法：把第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋至少100倍后作為模板，再擴(kuò)增一輪，產(chǎn)物的量可能就達(dá)到你的實驗要求了 |
7樓2014-03-31 01:07:51
【答案】應(yīng)助回帖
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dingcong1216(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-07-17 12:26:51
dingcong1216(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-07-17 12:26:51
| 給你幾個建議：一、請指明你說用的MARKER類型、目的條帶大概長度；二、把你的引物序列也一同放在上面，分子、基因這塊的影響因素很多、不確定性很高，需要很多條件來幫你分析排查原因；三、一般引物較短的情況下，變性、復(fù)性和延伸的時間比例為1:1:2的關(guān)系，你可以分別設(shè)置為30s、30s、60s，或者是40s、40s、90s；四、把你的PCR體系放上來，出現(xiàn)引物二聚體的原因可能是引物濃度過高或者是引物的特異性不高，你就只給我們一個PCR成像圖和反應(yīng)參數(shù)，我們沒辦法具體分析，希望你下次能注意些兒。 |
8樓2014-07-17 09:18:39
jurkat.1640
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