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biostar2009專家顧問(wèn) (正式寫(xiě)手)
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TouchDown PCR的基本原理和主要優(yōu)勢(shì) 已有7人參與
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總能看見(jiàn)有人關(guān)注touchdown PCR，但是感覺(jué)很多人并不清楚原理。 touchdown PCR的主要特色就是逐步降低PCR中的annealing溫度，主要目的是提高PCR的特異性，或者降低非特異性的產(chǎn)物。 但是逐步降低PCR annealing溫度，如何就能起到降低非特異性產(chǎn)物的作用呢？ 所謂的非特異性產(chǎn)物，本質(zhì)上是引物的錯(cuò)配，引物與模板中的其他位置能夠產(chǎn)生足夠引起延伸的錯(cuò)配。 比如20nt的引物，與設(shè)計(jì)的擴(kuò)展位置肯定是20個(gè)好好的完全配對(duì)，Tm值有60oC， 而在模板的某一個(gè)其他位置，還是這個(gè)引物，能夠與某段序列有19nt的配對(duì)，Tm值有59.5oC，假設(shè)。 這里還要明白，Tm是什么意思？是兩條DNA之間有50%發(fā)生配對(duì)的溫度，也就是說(shuō)，一個(gè)Tm=60oC的引物，在60oC時(shí)，有一半的free primer可以發(fā)生配對(duì)。那在58oC時(shí)可能是60%，而在65oC時(shí)可能是30%。 回到這樣一種情況，如果PCR的annealing溫度設(shè)置在58oC，這條引物在這兩個(gè)位置的annealing程度相差不大，所以這兩個(gè)地方均可以實(shí)現(xiàn)相當(dāng)程度的延伸。 但是如果還是這種情況，在touchdown PCR的程序中，從一個(gè)很高溫度向引物Tm donwn的過(guò)程中，會(huì)發(fā)生什么情況呢？ 會(huì)有那么一個(gè)溫度，在這個(gè)溫度上，完美配對(duì)的引物結(jié)合位置，能夠引發(fā)一次有效的延伸，而完美配對(duì)的引物結(jié)合位置，因?yàn)橐锏呐鋵?duì)效率低，沒(méi)能引發(fā)一次有效的延伸。或者更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼f(shuō)法是，會(huì)有那么一段溫度區(qū)間。完美配對(duì)的引物結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)于不完美配對(duì)的位點(diǎn)，會(huì)以更高的效率延伸。要注意，這點(diǎn)區(qū)別在一開(kāi)始可能是非常細(xì)微的區(qū)別。 一個(gè)簡(jiǎn)單的計(jì)算，某個(gè)引物存在A和B兩個(gè)結(jié)合位置，A處是完美配對(duì)，B處略微的錯(cuò)配，Tm可能只差0.2oC 即便如此，比如在70oC時(shí)，A處延伸了3個(gè)分子，而因?yàn)锽處引物配對(duì)效率較低，只延伸了1個(gè)分子。 那么到了下一個(gè)cycles時(shí)，完美配對(duì)的結(jié)合位置將是3+1=4個(gè)，而不完美配對(duì)只有1+1=2個(gè)。 這就實(shí)現(xiàn)了差距化，在隨后的cycles中，這種差距將進(jìn)行指數(shù)性的擴(kuò)大。 這就是touchdown能夠消除雜帶的原因。哪怕錯(cuò)配位點(diǎn)與完美配對(duì)位點(diǎn)只有細(xì)微的Tm區(qū)別。 所以設(shè)置touchdown程序的時(shí)候，要注意把溫度梯度拉大一些。 我的經(jīng)驗(yàn)，一般而言，從74oC開(kāi)始，到60oC，可以顯著的提高特異性。 對(duì)于一些更差的引物，從更高的80oC開(kāi)始，可以比74oC有明顯提高。 這個(gè)需要預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，也不是說(shuō)從95oC開(kāi)始最好了，這樣導(dǎo)致程序變得很長(zhǎng)時(shí)間。滿足需要就可以了。 所以同理可以看出，為什么說(shuō)touchdown只是錦上添花，如果主帶都看不出來(lái)，touchdown能夠發(fā)揮的空間就不大了。 最后還有一個(gè)觀點(diǎn)，PCR產(chǎn)物的特異性是由上下游兩個(gè)引物共同決定的 比如引物A和B，對(duì)mRNA α是完美引物，是上下游關(guān)系。 而發(fā)現(xiàn)引物A在mRNA β上還有一個(gè)一模一樣的結(jié)合位點(diǎn)。 引物B在mRNAγ上也有一個(gè)一模一樣的結(jié)合位點(diǎn)。 對(duì)于α mRNA而言，A和B是指數(shù)擴(kuò)增，而β和γ mRNA均是線性擴(kuò)增，隨著PCR的進(jìn)行，模板濃度會(huì)急劇下降。 所以設(shè)計(jì)引物的時(shí)候錯(cuò)配并不要緊，要緊是在同一條mRNA，或者DNA上是否有錯(cuò)配。 |
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2樓2014-03-28 23:08:15
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3樓2014-04-02 19:24:24
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謝謝分享 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
4樓2014-04-11 15:55:24
送紅花一朵
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5樓2014-10-12 23:20:21
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7樓2018-11-19 20:14:58
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8樓2022-12-30 17:03:29
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