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herjasmine新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
WB掃膜出現(xiàn)背景深且有些條帶呈白亮狀是怎么回事？ 已有3人參與
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| 之前做的一直很好。最近老是出現(xiàn)背景很深而有雜帶的情況，膜上還有些條帶白的發(fā)亮，也不知道是不是目標(biāo)條帶（雜帶太多）。且換了抗體后還是會(huì)出現(xiàn)這樣的問(wèn)題，而實(shí)驗(yàn)室有其他老師做出來(lái)也是這樣的情況（做的抗體和蛋白都不同）。大家認(rèn)為可能是什么原因造成的呢？ |
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2樓2014-03-28 21:48:29
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5樓2014-03-29 10:25:18
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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WB背景高的可能原因與解決方法 1.洗膜不充分，增加洗滌液的體積和洗滌次數(shù)；在洗滌液中加入Tween=20。 2.二抗?jié)舛冗^(guò)高，引起了一些非專一性的抗原-抗體相互作用，適當(dāng)降低二抗?jié)舛�，可以分梯度進(jìn)行。 3.二抗的識(shí)別抗原免疫簇不唯一，這是因?yàn)槎故嵌嗫寺】贵w，使用單克隆抗體的二抗，此時(shí)二抗的識(shí)別抗原免疫簇是唯一的，其非專一性的抗原-抗體相互作用會(huì)大為減少。當(dāng)然，有時(shí)，單克隆抗體也會(huì)有識(shí)別抗原免疫簇不唯一，如果兩種蛋白質(zhì)的抗原免疫簇的結(jié)構(gòu)很相近的話。如果不知道是不是二抗的識(shí)別抗原免疫簇不唯一，可以不加一抗的情況下只加二抗實(shí)驗(yàn)，可以檢測(cè)出是否為二抗的的抗原免疫簇的識(shí)別的原因，若是的話，可以先更換封閉試劑，若無(wú)效，則要同時(shí)更換二抗。 4.封閉不充分，增加封閉液的封閉時(shí)間，適當(dāng)提高溫度，更換封閉液。 5.曝光過(guò)度，縮短曝光時(shí)間。 6.檢測(cè)過(guò)程中膜干燥，保持充分的反應(yīng)液，避免膜干燥。 7．若無(wú)別的選擇，可嘗試選擇5%的脫脂奶粉，同時(shí)加入Tween=20。 8.滴定一抗或二抗的效價(jià)，找到一個(gè)產(chǎn)生清晰的信號(hào)強(qiáng)度可以接受的較低的抗體濃度。 9.縮短一抗和二抗的孵育時(shí)間。 |
6樓2014-07-18 10:28:46
凌波麗
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7樓2014-07-18 10:29:13
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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WB出現(xiàn)非特異性條帶的原因與解決方法： 1.抗體濃度過(guò)高；降低一抗、二抗的濃度。 2.一抗的特異性不足；使用單克隆抗體。 3.二抗的非特異性結(jié)合，不加一抗，其他操作不變，即可檢測(cè)出二抗的非特異性的條帶是否來(lái)自二抗的非特異性結(jié)合；此時(shí)需要重新選擇二抗。 4.樣品蛋白質(zhì)上樣量過(guò)大；降低上樣量。 5.樣品蛋白質(zhì)發(fā)生了降解，降解產(chǎn)物成為了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是單克隆抗體時(shí)更為明顯；避免對(duì)樣品蛋白質(zhì)反復(fù)凍融，食用新鮮的蛋白質(zhì)樣品，可以使用蛋白酶的廣譜抑制劑（已經(jīng)有商用產(chǎn)品），必要的話使用分子篩層析或HPLC純化蛋白質(zhì)樣品后再上樣（HPLC不能用于蛋白質(zhì)制備，不過(guò)用做WB的量還是能夠提供的）。 6.細(xì)胞傳代過(guò)多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變異。使用傳代次數(shù)少的細(xì)胞的表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)比，并且作為分子篩層析或HPLC的純化標(biāo)準(zhǔn)。 |
8樓2014-07-18 10:31:36
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9樓2014-07-18 10:32:33
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