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windflee鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
PEI25k介導(dǎo)外源pORF-Lacz基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞不成功
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本人輕化工程出身，研究專業(yè)是高分子材料，研究方向主要是基因轉(zhuǎn)染�？赡芎托率衷蛴嘘P(guān)，實驗諸多不順，特求助。 前段時間合成了兩種基因轉(zhuǎn)染用載體，并和PEI25k進(jìn)行了轉(zhuǎn)染的比較，已經(jīng)反復(fù)做了很多次了，但一直沒有得到可用的數(shù)據(jù)。特別詭異的是經(jīng)典體系PEI25k也沒能轉(zhuǎn)染出來，心中也是特別焦急，不知從何下手。 我的過程如下： 在24孔板中分為7組，每組設(shè)3復(fù)孔。給藥條件及細(xì)胞生長狀態(tài)見下表： 組別 給藥條件 細(xì)胞攝取4h后狀態(tài) 繼續(xù)培養(yǎng)48h后狀態(tài) BLANK 加入50μL的PBS溶液 良好 長滿 PEI25-2 N/P=15，c(Lacz)=4μg/mL 大部分死亡 大部分死亡 PEI25-1 N/P=15，c(Lacz)=2μg/mL 良好 長滿 GNPS-2 N/P=15，c(Lacz)=4μg/mL 良好 長滿 GNPS-1 N/P=15，c(Lacz)=2μg/mL 良好 長滿 GNRS-2 N/P=15，c(Lacz)=4μg/mL 良好 長滿 GNRS-1 N/P=15，c(Lacz)=2μg/mL 良好 長滿 轉(zhuǎn)染過程：細(xì)胞接24孔板后，當(dāng)生長至70%～80%融合時，用PBS清洗兩次，每孔加入0.5mL培養(yǎng)基（無血無抗）。接著每孔加入相應(yīng)的共50μL的DNA/載體復(fù)合物（用無血無清抗生素1640培養(yǎng)基配制，孵育30min），培養(yǎng)4h后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。 接著對細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果進(jìn)行分析，加Ripa裂解液100μL,然后分別測單位體積細(xì)胞裂解液的β-gal活性及總蛋白含量。 每孔的總蛋白含量是正常的，大多數(shù)的組都超過了0.5μg/μL,不過β-gal活性普遍較低，均在0.06-0.1mU/μL范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)染結(jié)果相當(dāng)不理想。因為PEI25-2組細(xì)胞大部分死亡，結(jié)果已失真，這里就不作比較了。轉(zhuǎn)染率的表示方法為每mg蛋白中β-gal的活性單位數(shù)，結(jié)果如下所示： 平均值(mU/mg) 標(biāo)準(zhǔn)差（mU/mg） blank 23.19113 3.036485 GNPS-2 43.63505 10.42721 GNRS-2 69.20421 8.292071 PEI25-1 63.88245 7.986505 GNPS-1 12.92375 0.071804 GNRS-1 30.30228 7.590619 另外，對不同載體進(jìn)行了MTT毒性測試，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的耐受性似乎差了很多，不知道是不是細(xì)胞原因造成的。 現(xiàn)在，實驗陷入了瓶頸期，我大致羅列了一下原因，可能有以下幾方面： 1、細(xì)胞的狀態(tài)不佳，不能很好地表達(dá)外源基因（可能和細(xì)胞接板前已匯合成片、細(xì)胞本身狀態(tài)有關(guān)） 2、DNA/載體復(fù)合物形成不佳，DNA沒能很好地轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)部 3、培養(yǎng)時間過長，比較疑惑吧。因為這樣的轉(zhuǎn)染肯定是屬于瞬時轉(zhuǎn)染，報道稱24h-96h都應(yīng)該是合適的，難道不同細(xì)胞的最適時間不同么 4、做實驗的心情太糟，細(xì)胞就變相報復(fù)了 我想說，有沒有哪位大俠可以拯救下我呀，因為實驗一直失敗的感覺真的很難受。這已經(jīng)是我第六次做轉(zhuǎn)染了，我找了好久原因，但是問題出在哪呢？現(xiàn)在當(dāng)務(wù)之急是PEI25k必須得出正常的結(jié)果，要不然接下來的實驗沒法做了。感謝各位了 |
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jinjiting
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