 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1331 | 回復: 4 | ||
| 當前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | ||
windflee鐵蟲 (小有名氣)
|
[求助]
PEI25k介導外源pORF-Lacz基因轉染HepG2細胞不成功
|
|
|
本人輕化工程出身，研究專業(yè)是高分子材料，研究方向主要是基因轉染�？赡芎托率衷蛴嘘P，實驗諸多不順，特求助。 前段時間合成了兩種基因轉染用載體，并和PEI25k進行了轉染的比較，已經反復做了很多次了，但一直沒有得到可用的數(shù)據(jù)。特別詭異的是經典體系PEI25k也沒能轉染出來，心中也是特別焦急，不知從何下手。 我的過程如下： 在24孔板中分為7組，每組設3復孔。給藥條件及細胞生長狀態(tài)見下表： 組別 給藥條件 細胞攝取4h后狀態(tài) 繼續(xù)培養(yǎng)48h后狀態(tài) BLANK 加入50μL的PBS溶液 良好 長滿 PEI25-2 N/P=15，c(Lacz)=4μg/mL 大部分死亡 大部分死亡 PEI25-1 N/P=15，c(Lacz)=2μg/mL 良好 長滿 GNPS-2 N/P=15，c(Lacz)=4μg/mL 良好 長滿 GNPS-1 N/P=15，c(Lacz)=2μg/mL 良好 長滿 GNRS-2 N/P=15，c(Lacz)=4μg/mL 良好 長滿 GNRS-1 N/P=15，c(Lacz)=2μg/mL 良好 長滿 轉染過程：細胞接24孔板后，當生長至70%～80%融合時，用PBS清洗兩次，每孔加入0.5mL培養(yǎng)基（無血無抗）。接著每孔加入相應的共50μL的DNA/載體復合物（用無血無清抗生素1640培養(yǎng)基配制，孵育30min），培養(yǎng)4h后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。 接著對細胞轉染結果進行分析，加Ripa裂解液100μL,然后分別測單位體積細胞裂解液的β-gal活性及總蛋白含量。 每孔的總蛋白含量是正常的，大多數(shù)的組都超過了0.5μg/μL,不過β-gal活性普遍較低，均在0.06-0.1mU/μL范圍內，轉染結果相當不理想。因為PEI25-2組細胞大部分死亡，結果已失真，這里就不作比較了。轉染率的表示方法為每mg蛋白中β-gal的活性單位數(shù)，結果如下所示： 平均值(mU/mg) 標準差（mU/mg） blank 23.19113 3.036485 GNPS-2 43.63505 10.42721 GNRS-2 69.20421 8.292071 PEI25-1 63.88245 7.986505 GNPS-1 12.92375 0.071804 GNRS-1 30.30228 7.590619 另外，對不同載體進行了MTT毒性測試，發(fā)現(xiàn)細胞的耐受性似乎差了很多，不知道是不是細胞原因造成的。 現(xiàn)在，實驗陷入了瓶頸期，我大致羅列了一下原因，可能有以下幾方面： 1、細胞的狀態(tài)不佳，不能很好地表達外源基因（可能和細胞接板前已匯合成片、細胞本身狀態(tài)有關） 2、DNA/載體復合物形成不佳，DNA沒能很好地轉運到細胞內部 3、培養(yǎng)時間過長，比較疑惑吧。因為這樣的轉染肯定是屬于瞬時轉染，報道稱24h-96h都應該是合適的，難道不同細胞的最適時間不同么 4、做實驗的心情太糟，細胞就變相報復了 我想說，有沒有哪位大俠可以拯救下我呀，因為實驗一直失敗的感覺真的很難受。這已經是我第六次做轉染了，我找了好久原因，但是問題出在哪呢？現(xiàn)在當務之急是PEI25k必須得出正常的結果，要不然接下來的實驗沒法做了。感謝各位了 |
回復此樓» 猜你喜歡
324分 085600材料化工求調劑
已經有3人回復
-
317求調劑
已經有6人回復
-
0817 化學工程 299分求調劑 有科研經歷 有二區(qū)文章
已經有11人回復
-
307求調劑
已經有5人回復
-
求調劑
已經有3人回復
-
求調劑，一志愿:南京航空航天大學大學 ，080500材料科學與工程學碩，總分289分
已經有3人回復
-
化學求調劑
已經有4人回復
-
招收調劑碩士
已經有9人回復
-
0703化學調劑
已經有8人回復
-
0703化學調劑
已經有3人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- HepG2細胞復蘇不成功，求解!
已經有9人回復
- 請問用不加血清的DMEM培養(yǎng)基時，HepG2細胞還會長么，數(shù)目會變多么？
已經有16人回復
4樓2018-10-09 16:50:25
3樓2015-06-12 11:13:24
5樓2019-03-19 15:37:16
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 328求調劑，英語六級551，有科研經歷 +4 | 生物工程調劑 2026-03-16 | 12/600 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 354求調劑 +4 | Tyoumou 2026-03-18 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 【同濟軟件】軟件（085405）考研求調劑 +3 | 2026eternal 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 26調劑/材料/英一數(shù)二/總分289/已過A區(qū)線 +7 | 步川酷紫123 2026-03-13 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 08工科 320總分 求調劑 +5 | 梨花珞晚風 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 311求調劑 +11 | 冬十三 2026-03-15 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 299求調劑 +5 | △小透明* 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料專碩326求調劑 +6 | 墨煜姒莘 2026-03-15 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料工程專碩274一志愿211求調劑 +6 | 薛云鵬 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 東南大學364求調劑 +5 | JasonYuiui 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 304求調劑 +5 | 素年祭語 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 326求調劑 +3 | mlpqaz03 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 327求調劑 +6 | 拾光任染 2026-03-15 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 22408總分284求調劑 +3 | InAspic 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料與化工 323 英一+數(shù)二+物化，一志愿：哈工大 本人本科雙一流 +4 | 自由的_飛翔 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料工程調劑 +9 | 咪咪空空 2026-03-12 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0856材料與化工301求調劑 +5 | 奕束光 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 311求調劑 +3 | 冬十三 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 309分請求調劑 +7 | dtdxzxx 2026-03-12 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 321求調劑（食品/專碩） +3 | mxcz321 2026-03-12 | 6/300 |
|