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包涵體蛋白做間接ELISA，顯色不穩(wěn)定，望做過的高手幫忙看一下，萬分感激�。�！
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最近在用包涵體蛋白做間接ELISA,但是實驗做的不是很順利,最后加上顯色液TMB后顯色不穩(wěn)定，有時候顯色，有時候不顯色，實驗過程、操作以及試劑都檢查過了，不會有錯。后來考慮是不是問題出在這個包涵體蛋白上面，包涵體純化，變性劑是尿素，也查了一些相關(guān)的知識、帖子，總結(jié)如下： 1、變性的融合蛋白做抗原是沒有影響的，gst的分子量是26kda，當然，如果將融合伴侶除去，抗體的特異性會要更好一些，如果不除，影響也不會很大。最好進行透析，除去溶液中的雜物質(zhì)，但是Tris沒有什么關(guān)系，其就如同PBS一樣，本身是緩沖體系，不會對免疫造成太大影響。 2、做抗原的話，變性了沒關(guān)系的；純化后可以直接免疫動物，我們這就有人做，不過他是用的His融合表達；掛著GST挺好的，不切也行，蛋白大些豈不是抗原性更強些 這2種說法覺得包涵體純化后可以直接包被了，也沒有復(fù)性，做ELISA, 不會受到影響，反而覺得 會更好些 3、帖子：這個問題我想了很久，不過現(xiàn)在也只能給你提供點建議試試，不一定成熟。 我查了一篇文章，后面也附給你，你可以看看，我們一起討論。 文章中用豬瘟病毒的E2原核表達蛋白來包被ELISA，這種蛋白也是不可溶的，作者使用碳酸鹽緩沖系統(tǒng)包被，然后加入鹽酸胍增加蛋白質(zhì)的可溶性（還可以適當?shù)闹蠓校�，從而提高包被系統(tǒng)的均勻性，提高檢測的靈敏性和可重復(fù)性。 這篇文章我一直沒有找到，找到幾篇類似的，但沒有提到”作者使用碳酸鹽緩沖系統(tǒng)包被，然后加入鹽酸胍增加蛋白質(zhì)的可溶性”這句話 其實一直還是有一個疑問，包涵體是不可溶的，但是經(jīng)過變性之后，是不是可以算是可溶性的了？那這樣應(yīng)該不能包被不上？而且純化出的蛋白的確也沒有沉淀， 望做過的高手幫忙看一下，萬分感激�。�！ |
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