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[求助]
包涵體蛋白做間接ELISA，顯色不穩(wěn)定，望做過(guò)的高手幫忙看一下，萬(wàn)分感激�。�！
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最近在用包涵體蛋白做間接ELISA,但是實(shí)驗(yàn)做的不是很順利,最后加上顯色液TMB后顯色不穩(wěn)定，有時(shí)候顯色，有時(shí)候不顯色，實(shí)驗(yàn)過(guò)程、操作以及試劑都檢查過(guò)了，不會(huì)有錯(cuò)。后來(lái)考慮是不是問(wèn)題出在這個(gè)包涵體蛋白上面，包涵體純化，變性劑是尿素，也查了一些相關(guān)的知識(shí)、帖子，總結(jié)如下： 1、變性的融合蛋白做抗原是沒(méi)有影響的，gst的分子量是26kda，當(dāng)然，如果將融合伴侶除去，抗體的特異性會(huì)要更好一些，如果不除，影響也不會(huì)很大。最好進(jìn)行透析，除去溶液中的雜物質(zhì)，但是Tris沒(méi)有什么關(guān)系，其就如同PBS一樣，本身是緩沖體系，不會(huì)對(duì)免疫造成太大影響。 2、做抗原的話，變性了沒(méi)關(guān)系的；純化后可以直接免疫動(dòng)物，我們這就有人做，不過(guò)他是用的His融合表達(dá)；掛著GST挺好的，不切也行，蛋白大些豈不是抗原性更強(qiáng)些 這2種說(shuō)法覺(jué)得包涵體純化后可以直接包被了，也沒(méi)有復(fù)性，做ELISA, 不會(huì)受到影響，反而覺(jué)得 會(huì)更好些 3、帖子：這個(gè)問(wèn)題我想了很久，不過(guò)現(xiàn)在也只能給你提供點(diǎn)建議試試，不一定成熟。 我查了一篇文章，后面也附給你，你可以看看，我們一起討論。 文章中用豬瘟病毒的E2原核表達(dá)蛋白來(lái)包被ELISA，這種蛋白也是不可溶的，作者使用碳酸鹽緩沖系統(tǒng)包被，然后加入鹽酸胍增加蛋白質(zhì)的可溶性（還可以適當(dāng)?shù)闹蠓校�，從而提高包被系統(tǒng)的均勻性，提高檢測(cè)的靈敏性和可重復(fù)性。 這篇文章我一直沒(méi)有找到，找到幾篇類似的，但沒(méi)有提到”作者使用碳酸鹽緩沖系統(tǒng)包被，然后加入鹽酸胍增加蛋白質(zhì)的可溶性”這句話 其實(shí)一直還是有一個(gè)疑問(wèn)，包涵體是不可溶的，但是經(jīng)過(guò)變性之后，是不是可以算是可溶性的了？那這樣應(yīng)該不能包被不上？而且純化出的蛋白的確也沒(méi)有沉淀， 望做過(guò)的高手幫忙看一下，萬(wàn)分感激�。�！ |
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會(huì)思想的蘆葦
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2樓2014-04-08 14:43:27
3樓2014-04-08 21:25:10
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