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IP后WB，蛋白比預(yù)期的大，正反拉蛋白都做了，都是大十幾kD 已有4人參與
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最近在苦一個(gè)圖，所以做了個(gè)ChIP，然后用我的目標(biāo)蛋白（蛋白A）做WB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜出來(lái)的帶比蛋白A的理論大小大十幾kD。 我們懷疑可能是非特異性條帶的結(jié)合，于是嘗試用蛋白A做CO-IP，然后用ChIP的抗體做WB，發(fā)現(xiàn)雜出來(lái)的帶也比預(yù)計(jì)的大十幾kD。 現(xiàn)在懷疑可能情況有一下幾種： 1.發(fā)生了什么修飾 造成蛋白變大 2.結(jié)合了其他分子 但是由于WB是變性的 所以這一點(diǎn)上我們持有懷疑意見(jiàn) 3.非特異性結(jié)合 這一點(diǎn)上急需方法來(lái)排除，希望高手可以指教一下 我們實(shí)驗(yàn)室一直做RNA相關(guān)實(shí)驗(yàn)，最近才開(kāi)始摸索Chromatin相關(guān)實(shí)驗(yàn)，小菜鳥(niǎo)滿臉血跪求指教 OTZ |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
逆天打醬油: 金幣+5, ★有幫助 2014-04-28 09:38:04
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
逆天打醬油: 金幣+5, ★有幫助 2014-04-28 09:38:04
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用質(zhì)譜測(cè)定一下蛋白質(zhì)樣品，很容易知道是否發(fā)生了共價(jià)修飾（相對(duì)分子量增加了），發(fā)生了則或者發(fā)生了細(xì)胞內(nèi)的翻譯后的修飾，或者是體外操作過(guò)程中發(fā)生了bioconjugation，不少的醛類化合物本身就會(huì)引起蛋白質(zhì)交聯(lián)，而不僅是引起蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)。 如果質(zhì)譜相對(duì)分子量增加了相對(duì)的分子量增加，則改變有關(guān)的溶液環(huán)境，促使蛋白質(zhì)溶解，比如加入表面活性劑，可以參考拆分蛋白質(zhì)多聚體為單體的試驗(yàn)方法可以參考親和層析的試驗(yàn)方法。 拆分蛋白質(zhì)多聚體為單體的試驗(yàn)方法可以參考親和層析的試驗(yàn)方法： （1）改變pH值或離子強(qiáng)度：比如可以使用NaCl梯度拆解，主要是用于靜電作用引起的相互作用的蛋白質(zhì)多聚體，改變pH值可以跟緩沖溶液的組成加入相應(yīng)的酸或者堿； （2）如果蛋白質(zhì)多聚體主要為疏水相互作用，而且改變pH值的結(jié)果不夠有效，則需要用激烈的條件，比如加入聚乙二醇（最多到到60%，要分梯度加入）或二甲基亞砜（dimethylsulfoxide）（一般最多到到10%，要分梯度加入）以降低水溶液的極性 （3）可以考慮加入加入去垢劑(表面活性劑)，它們是具有親水基又具有疏水基的物質(zhì)，能夠在低于臨界膠束濃度（Citical Micelle Concentration ，簡(jiǎn)稱：CMC）時(shí)有效結(jié)合于蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域，因此一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分陰離子、陽(yáng)離子和中性去垢劑等多種類型，中性去垢劑在蛋白提取 鐘應(yīng)用的較多。 一般考慮使用的是：中性去垢劑或生物表面活性劑。 中性去垢劑 又稱非離子表面活性劑，對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用影響較少，宜于蛋白質(zhì)或酶提取之用。一般市售中性去垢劑有聚乙二醇類，如PEG200；多元醇類表面活性劑，如 山梨醇、司 盤(pán)類和吐溫類；聚氧乙烯脂肪醇醚，如芐澤類、平平加類；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如Igepal CO、乳化劑OP、Triton、Pluronic(用作消泡劑、潤(rùn)濕劑、增溶劑)、泡敵。中性去垢劑作用后可通過(guò)Sephadex LH-50柱除去；也可直接上DEAE-Sephadex柱層析分離目的蛋白，不必先除去去垢劑。 也可以用天然表面活性劑 又稱為生物表面活性劑，包括種類較為廣泛，如各種樹(shù)膠（阿拉伯膠、杏膠、桃膠、果膠）、明膠、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、瓊脂、海藻酸鈉、酪蛋白、膽甾醇、膽 酸類、多糖類（如環(huán)糊精）等。 具體用法可以參考有關(guān)試劑使用說(shuō)明。濃度盡量低一些為好，濃度不能超過(guò)臨界膠束濃度（Citical Micelle Concentration ，簡(jiǎn)稱：CMC）。 臨界膠束濃度cmc的含義如下： 在水中的表面活性劑低濃度時(shí)呈分子狀態(tài)，并且三三兩兩地把親油基團(tuán)靠攏而分散在水中，當(dāng)濃度逐漸增大一定程度時(shí)，許多表面活性劑分子立刻結(jié)合成大基團(tuán)，形成“膠束”表面活性劑在水中形膠束所需的最低濃度稱為臨街膠束濃度，即CMC. 意義：CMC可作為表面活性劑表面活性的一種度量，CMC越小，表明這種活性劑形成膠束所需的濃度越低，達(dá)到表面飽和吸附的濃度越低。因而改變表面性質(zhì)從 而起到潤(rùn)濕，乳化，增溶，起泡等作用所需的濃度也越低。此外，臨界膠束濃度也是表面活性劑溶液性質(zhì)發(fā)生顯著變化的一個(gè)分水嶺，CMC值對(duì)表面活性劑的研究 有著及其重要的參考價(jià)值的數(shù)據(jù)。 臨界膠束濃度測(cè)定方法很多，用不同方法驗(yàn)證即可 （1）表面張力法 http://www.anatrace.com/tech_tips/TechBul_105.pdf （2）電導(dǎo)率法 方法＆原理http://151.fosu.edu.cn/hxsy/wuli ... daofajiaosu%20z.htm http://u.edu.cn/UpLoadFile/20080119080151.doc （3）紫外吸收分光光譜 http://www.ilib.cn/A-hxxb200624009.html （4）.芘熒光探針光譜法 http://www.ilib.cn/A-shjsyyy200701012.html 其中芘熒光探針光譜法可信度較高 （5）Citical Micelle Concentration by Conductance and Raman http://ed.augie.edu/~awaspaas/pchem/labs/cmc/cmc.html （4）也可以采用高濃度的（到3mol/L）的離子解離鹽（比如KCN或KI）或中低濃 度的變性劑（低于4mol/L）的尿素或鹽酸胍，都是分梯度加入。 總之，只要能拆解開(kāi)多聚體即可，盡量少或不要變性，拆解后可用層析方法或者離心方法分離開(kāi)多聚體和單體，分離開(kāi)的多聚體再如前法循環(huán)操作分離到單體。 |
9樓2014-04-26 10:07:30
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2樓2014-04-24 10:46:32
jurkat.1640
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