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yyc12596新蟲 (著名寫手)
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[交流]
170kDa膜蛋白MRP1跑WB遇到問題 已有7人參與
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需要做一個膜蛋白，MRP1，分子量170kDa. WB一直遇到問題，沒有拿到自己的目的條帶。 使用了Thermo的膜蛋白提取試劑盒，細胞裂解和離心都是在冰上或者四度進行的。膜蛋白和胞漿蛋白在-20度凍存。 因為膜蛋白100度煮沸5分鐘據(jù)說會沉淀，所以樣本解凍之后1:1加lamaelli（5%2-ME）loading buffer，37度溫育30分鐘，然后直接上樣。BIO-RAD的4-15%的膠。 之后恒壓100V,濕轉(zhuǎn)2小時。中間換一次冰盒。電流從0.3A會增高到0.45A. 封閉，一抗，二抗，顯影。 標本用了人THP-1細胞株（未用PMA分化），以及人血來源的巨噬細胞（M-CSF分化）。 一抗用了R&D的MRP1(QCRL,MAB19291),Abcam的MRP1(IU2H10，識別MRP1的1-33aa)。兩支抗體孵育出的條帶都在55kDa大小！ 下圖是Abcam一抗孵育之后。 |
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1% benzonase的作用： Benzonase® endonuclease has been especially designed for applications in biotechnological processing, such as: • removing DNA/RNA from proteins and other biologicals • reducing viscosity caused by nucleic acids • preparing samples in electrophoresis and chromatography • preventing cell clumping 這一步可能是關(guān)鍵步驟嗎？也許需要買一下這個酶，加到樣本里去。 |
5樓2014-04-30 04:00:07
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9樓2014-05-02 05:23:34
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10樓2014-05-02 05:28:51
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FACS問題解決方案： 1.懷疑透膜和固定不夠。之前用了eBioscience的固定劑4度過夜，然后用它的透膜劑。現(xiàn)在準備試試4%PFA固定，0.3%TritonX100透膜，然后染直標抗體看看。間標抗體上次陽性，現(xiàn)在拿來做陽性對照。 2.懷疑BD的抗體有問題。不過BD的流式抗體一直很好用，現(xiàn)在買的直標抗體確實是抗人的，F(xiàn)ITC通道，過期時間是明年。各方面看起來都正常。所以，對抗體的懷疑會放到最后，先驗證其他問題。 3.細胞株有問題。WB和熒光染色都沒問題，所以基本不存在細胞株本身沒有這個蛋白的問題。 做實驗老遇到這種無聊的原因，想著根本不可能做不出來的時候，偏偏會出點問題做不出來。 |
24樓2014-07-03 03:47:11
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是的。就是BIO-RAD公司買的那種loading buffer, 直接拿來裂解細胞了。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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carolyn_cat29樓2016-06-17 09:32:27
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2樓2014-04-30 03:43:06
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文獻上的方法： Latency-Associated Degradation of the MRP1 Drug Transporter During Latent Human Cytomegalovirus Infection Michael P. Weekes, Shireen Y. L. Tan, Emma Poole, Suzanne Talbot, Robin Antrobus, Duncan L. Smith, Christina Montag, Steven P. Gygi, John H. Sinclair, Paul J. Lehner* *Corresponding author. E-mail pjl30@cam.ac.uk Published 12 April 2013, Science 340, 199 (2013) Primary antibodies used for immunoblotting were: MRPr1 α-MRP1 (Enzo Life Sciences) Immunoblotting ： For immunoblots, cells were lysed in SDS sample buffer in TBS with 1% benzonase. Lysates were heated for 30 min at 37°C, separated by SDS/PAGE (UL138 -12% polyacrylamide gel; MRP1 - 7% polyacrylamide gel) and transferred to PVDF membranes (Millipore). For MRP1, membranes were denatured with 6M guanidinium chloride. Reactive bands were detected by SuperSignal West Pico or Dura substrates (Thermo). |
3樓2014-04-30 03:46:21
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現(xiàn)在懷疑目標蛋白是不是被降解了？55KDA的條帶讓人很不舒坦。 上樣： 2x Laemmli Sample Buffer #161-0737 Dilute protein samples 1:1 in 2x Laemmli sample buffer before loading on SDS-PAGE gels (requires the addition of β-mercaptoethanol). •Formulation: 65.8 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS, 26.3% (w/v) glycerol, 0.01% bromophenol blue |
4樓2014-04-30 03:51:57
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6樓2014-04-30 04:07:08
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找到一段鹽酸胍洗脫PVDF膜的說明： 一般stripping的原理都是利用蛋白變性以及利用beta-mercaptoethanol打開-s-s-，使一二抗解聚變性而被洗去，但洗脫的強度是一個關(guān)鍵，小了抗體洗不干凈影響re-probe，大了又造成抗原的損失 1、比較老的方法（需要50℃溫浴） Stripping Buffer:β-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；1MTris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至50 ml。 方法：將用過的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，間斷振搖。之后用TTBS洗5min/次洗到無beta-mercaptoethanol的味道就好。此時你已經(jīng)可以按新的轉(zhuǎn)移好的膜來再次使用了。 2、結(jié)合鹽酸胍的方法（僅適用PVDF，但這種方法抗原損失少，抗體洗脫也比較干凈，我們比較過后也一直在使用） Stripping Buffer：50mM Glycine-NaOH(pH10.8), 7M Guanidine hydrochloride, 100mM KCl, 0.2mM EDTA, add 22.5uL beta-Mercaptoethanol/10mL stripping buffer just before use. 1) After ECL development, wash membrane once for 10min with TBST/PBST. 2) Incubate the membrane in stripping buffer in a shake for 6-8min at RT. 3) Washed stripped membrane at least 3x for 8min each with TBST/PBST, then re-block. 這種方法stripping buffer可以重復(fù)利用2次，用時也較快，當然基于鹽酸胍的配方還有很多。 |
7樓2014-05-01 06:41:19
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8樓2014-05-01 06:50:57
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