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yyc12596新蟲 (著名寫手)
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[交流]
170kDa膜蛋白MRP1跑WB遇到問(wèn)題 已有7人參與
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需要做一個(gè)膜蛋白，MRP1，分子量170kDa. WB一直遇到問(wèn)題，沒(méi)有拿到自己的目的條帶。 使用了Thermo的膜蛋白提取試劑盒，細(xì)胞裂解和離心都是在冰上或者四度進(jìn)行的。膜蛋白和胞漿蛋白在-20度凍存。 因?yàn)槟さ鞍?00度煮沸5分鐘據(jù)說(shuō)會(huì)沉淀，所以樣本解凍之后1:1加lamaelli（5%2-ME）loading buffer，37度溫育30分鐘，然后直接上樣。BIO-RAD的4-15%的膠。 之后恒壓100V,濕轉(zhuǎn)2小時(shí)。中間換一次冰盒。電流從0.3A會(huì)增高到0.45A. 封閉，一抗，二抗，顯影。 標(biāo)本用了人THP-1細(xì)胞株（未用PMA分化），以及人血來(lái)源的巨噬細(xì)胞（M-CSF分化）。 一抗用了R&D的MRP1(QCRL,MAB19291),Abcam的MRP1(IU2H10，識(shí)別MRP1的1-33aa)。兩支抗體孵育出的條帶都在55kDa大��！ 下圖是Abcam一抗孵育之后。 |
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文獻(xiàn)上的方法： Latency-Associated Degradation of the MRP1 Drug Transporter During Latent Human Cytomegalovirus Infection Michael P. Weekes, Shireen Y. L. Tan, Emma Poole, Suzanne Talbot, Robin Antrobus, Duncan L. Smith, Christina Montag, Steven P. Gygi, John H. Sinclair, Paul J. Lehner* *Corresponding author. E-mail pjl30@cam.ac.uk Published 12 April 2013, Science 340, 199 (2013) Primary antibodies used for immunoblotting were: MRPr1 α-MRP1 (Enzo Life Sciences) Immunoblotting ： For immunoblots, cells were lysed in SDS sample buffer in TBS with 1% benzonase. Lysates were heated for 30 min at 37°C, separated by SDS/PAGE (UL138 -12% polyacrylamide gel; MRP1 - 7% polyacrylamide gel) and transferred to PVDF membranes (Millipore). For MRP1, membranes were denatured with 6M guanidinium chloride. Reactive bands were detected by SuperSignal West Pico or Dura substrates (Thermo). |
3樓2014-04-30 03:46:21
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2樓2014-04-30 03:43:06
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現(xiàn)在懷疑目標(biāo)蛋白是不是被降解了？55KDA的條帶讓人很不舒坦。 上樣： 2x Laemmli Sample Buffer #161-0737 Dilute protein samples 1:1 in 2x Laemmli sample buffer before loading on SDS-PAGE gels (requires the addition of β-mercaptoethanol). •Formulation: 65.8 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS, 26.3% (w/v) glycerol, 0.01% bromophenol blue |
4樓2014-04-30 03:51:57
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1% benzonase的作用： Benzonase® endonuclease has been especially designed for applications in biotechnological processing, such as: • removing DNA/RNA from proteins and other biologicals • reducing viscosity caused by nucleic acids • preparing samples in electrophoresis and chromatography • preventing cell clumping 這一步可能是關(guān)鍵步驟嗎？也許需要買一下這個(gè)酶，加到樣本里去。 |
5樓2014-04-30 04:00:07
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