韓元富豪

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[求助] 各位學(xué)長(zhǎng)、學(xué)姐幫幫忙，PCR只有引物二聚體已有11人參與

設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，Tm值分別是72℃、67.2℃，嘗試的溫度有66℃、65℃、64℃、63℃、62℃，但都只有引物二聚體，怎么辦，（先前提模板DNA時(shí)有條帶，但PCR的時(shí)候就只有引物二聚體了），已經(jīng)做了好長(zhǎng)時(shí)間了，怎么辦，求指點(diǎn)

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1樓 2014-05-05 11:02:08

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fuchange918

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韓元富豪(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-05-06 18:07:31
韓元富豪: 金幣+3, ★有幫助, 謝謝啦，我再試試 2014-05-09 13:06:13

如果是引物合成單上的退火溫度的話，根據(jù)它給的退火溫度減5度左右是很難P出來(lái)的，我一般用英俊合成引物，合成單上有兩個(gè)Tm值，一個(gè)大的一個(gè)小的，我的一般都是大的那個(gè)Tm值減去10度多才能跑出目的片段，不知道你的這個(gè)Tm值是怎么確定的，我估計(jì)是你P的那幾個(gè)退火溫度是太高了。建議以55度為中心，上下加減5度，共10個(gè)梯度，應(yīng)該就能出來(lái)了

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10樓2014-05-06 15:58:56

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zep616745243

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-05-05 15:55:49

確保模板沒(méi)有問(wèn)題的前提下，可以試試降低退火溫度吧，真不行就換引物吧

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只有不斷地失敗才會(huì)成功

2樓2014-05-05 12:26:24

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BioChen

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-05-05 15:55:56

你的模版是什么？基因組？
基因組DNA變性有點(diǎn)困難，可以考慮加DMSO。
把退火溫度降到50度，看看有沒(méi)有條帶。如果沒(méi)有條帶果斷換模版與引物。如果有帶，繼續(xù)優(yōu)化PCR條件。

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3樓2014-05-05 12:34:25

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韓元富豪

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引用回帖:

3樓: Originally posted by BioChen at 2014-05-05 12:34:25
你的模版是什么？基因組？
基因組DNA變性有點(diǎn)困難，可以考慮加DMSO。
把退火溫度降到50度，看看有沒(méi)有條帶。如果沒(méi)有條帶果斷換模版與引物。如果有帶，繼續(xù)優(yōu)化PCR條件。

模板是解淀粉芽孢桿菌中的pyrr基因，設(shè)計(jì)了兩組引物：上游同源臂和下游同源臂，PCR的時(shí)候都只是引物二聚體，查看了這個(gè)種的所有pyrr基因，在設(shè)計(jì)引物的那個(gè)片段，只有一個(gè)堿基不一樣，其他都一樣，下游同源臂引物未加被保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)的時(shí)候Tm是65.6和64.3，加了之后變成了72,67.2 。那Tm值多少合適呢

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4樓2014-05-05 14:28:12

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BioChen

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引用回帖:

4樓: Originally posted by 韓元富豪 at 2014-05-05 14:28:12
模板是解淀粉芽孢桿菌中的pyrr基因，設(shè)計(jì)了兩組引物：上游同源臂和下游同源臂，PCR的時(shí)候都只是引物二聚體，查看了這個(gè)種的所有pyrr基因，在設(shè)計(jì)引物的那個(gè)片段，只有一個(gè)堿基不一樣，其他都一樣，下游同源臂引物 ...

Tm值只是一個(gè)參考，我設(shè)計(jì)引物的時(shí)候基本上不太關(guān)注Tm值。無(wú)論Tm值是多少，我拿到引物之后，都會(huì)做一個(gè)梯度PCR，確定最佳退火溫度。
你現(xiàn)在的問(wèn)題是PCR出不來(lái)，所以盡可能的降低退火溫度，加DMSO是促進(jìn)基因組DNA的變性。
我問(wèn)的模版是什么不是問(wèn)你克隆什么基因，問(wèn)的是你的模版是基因組、cDNA還是質(zhì)粒？

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5樓2014-05-06 10:35:25

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引用回帖:

5樓: Originally posted by BioChen at 2014-05-06 10:35:25
Tm值只是一個(gè)參考，我設(shè)計(jì)引物的時(shí)候基本上不太關(guān)注Tm值。無(wú)論Tm值是多少，我拿到引物之后，都會(huì)做一個(gè)梯度PCR，確定最佳退火溫度。
你現(xiàn)在的問(wèn)題是PCR出不來(lái)，所以盡可能的降低退火溫度，加DMSO是促進(jìn)基因組DNA的 ...

模板是基因組

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6樓2014-05-06 12:20:39

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退火溫度58至60差不多了

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7樓2014-05-06 12:36:39

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韓元富豪: 金幣+2, 謝謝啦，我再試試 2014-05-09 13:06:58
韓元富豪: 金幣+2, ★★★很有幫助 2014-05-10 13:12:04

不知道引物多長(zhǎng)，但是我覺(jué)得退火溫度太高了，我一般都用54-56度；60度以上就是很難擴(kuò)增出來(lái)。

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8樓2014-05-06 15:13:36

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引物濃度退火溫度模板濃度都可調(diào)的

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頂頂頂

9樓2014-05-06 15:29:59

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