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yuehedou木蟲 (小有名氣)
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miRNA差異表達(dá)分析時(shí)reads數(shù)目的校準(zhǔn)（TPM）問題
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在做miRNA的差異表達(dá)分析時(shí)，很多文章里都要使用TPM（Transcripts per million，公式為：單一miRNA reads數(shù)×10^6/總reads數(shù)）來校準(zhǔn)miRNA的表達(dá)量，這樣做是為了去除pcr擴(kuò)增文庫時(shí)的偏倚嗎？ 然后，如果使用TPM進(jìn)行校準(zhǔn)，那也會(huì)產(chǎn)生另外的差異啊我覺得，舉個(gè)極端的例子：樣品A中實(shí)際總共表達(dá)了10個(gè)reads，其中miR1表達(dá)了2個(gè)；樣品B總共表達(dá)了100個(gè)reads，其中miR1表達(dá)了20個(gè)，——實(shí)際上在兩個(gè)樣品中miR1是顯著差異表達(dá)的，但經(jīng)TPM校準(zhǔn)后，兩個(gè)樣品中其表達(dá)量就都成了20 000，就一樣了么，那么校準(zhǔn)豈不是產(chǎn)生了原來沒有的錯(cuò)誤？？ 我覺得miRNA是短序列，不存在轉(zhuǎn)錄組中序列片段長短的問題，那么直接使用reads的count作為其相應(yīng)miRNA的表達(dá)量豈不是更好？ 歡迎討論！ |
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 miRNA測序數(shù)據(jù)分析 |
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myibm369
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其實(shí)你假設(shè)下就知道了，上機(jī)測序的total miRNA量 A為10ng其中miR1有1ng，B為10ng其中miRNA1有0.1ng，那么你最后測序得到的結(jié)果比例還是這樣的，A中miR1為10%，B中miR1為1%，都normalization到100，那么A的miR1是10，B的是1。 <quote>在測序深度同樣為10的情況下，樣品A中miR1表達(dá)了1，放大10倍就測得了10；B中miR1表達(dá)了10，放大10倍就成了100. 那我們后邊又進(jìn)行校準(zhǔn)，就人為地抹掉了這種差異——實(shí)際上它們卻是有顯著差異的。</quote> 校準(zhǔn)還是10：100哦，是有差異的啊。 |
4樓2014-05-06 12:13:49
myibm369
木蟲 (正式寫手)
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這其實(shí)是個(gè)normalization的過程，因?yàn)榧偃缒阌卸鄠�(gè)樣品（》=2），測序得到的total mapping reads的數(shù)目是不一樣的，大家必須normalize到同一個(gè)水平才方便比較。 你說的實(shí)際應(yīng)該是指細(xì)胞內(nèi)真正表達(dá)的數(shù)量吧，但是實(shí)際上通過測序你是拿不到真正意義上的絕對(duì)表達(dá)量，只是一個(gè)相對(duì)的表達(dá)量。我們在進(jìn)行2個(gè)或者多個(gè)樣品genes或者miRNA表達(dá)差異分析比較的時(shí)候，是默認(rèn)總體RNA表達(dá)的一樣多的。簡單來說就是你例子中sample A和B的RNA總量是一致的，不過A測序測到了10個(gè)reads，B測序測的比較多，拿到了100個(gè)reads，如果A也達(dá)到B的測序深度，其實(shí)miR1也就是20個(gè)reads，表達(dá)量是一致的。 不知道你明白否 |
2樓2014-05-06 09:24:15
yuehedou
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我覺得total mapping reads的數(shù)目不一樣才是正常的，因?yàn)槭遣煌瑯悠贰?fieldset> 你說的實(shí)際應(yīng)該是指細(xì)胞內(nèi)真正表達(dá)的數(shù)量吧…… 我說的是實(shí)際表達(dá)量。我認(rèn)為只要能控制建庫均勻度、測序深度，那得到的數(shù)據(jù)反映的應(yīng)該就是實(shí)際表達(dá)豐度，即使這種反映是將原來的表達(dá)量以一種集體相對(duì)的方式表現(xiàn)出來，例如將實(shí)際的表達(dá)量整體放大。因?yàn)閷?shí)際總體和單個(gè)的表達(dá)量就不一致，在測序深度同樣為10的情況下，樣品A中miR1表達(dá)了1，放大10倍就測得了10；B中miR1表達(dá)了10，放大10倍就成了100. 那我們后邊又進(jìn)行校準(zhǔn)，就人為地抹掉了這種差異——實(shí)際上它們卻是有顯著差異的。 |
3樓2014-05-06 11:53:03
yuehedou
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5樓2014-05-06 15:09:26
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