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最近在做EMSA的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)，如圖所示，從左到右。
1：1%BSA和標(biāo)記DNA對(duì)照
2：蛋白和標(biāo)記DNA
3：蛋白和標(biāo)記DNA 另外加了50倍的競(jìng)爭(zhēng)性DNA
4：蛋白和標(biāo)記DNA，另外加了50倍的非競(jìng)爭(zhēng)性DNA
請(qǐng)問第3條帶子為什么變淡了，按道理有競(jìng)爭(zhēng)性DNA上去后，標(biāo)記的DNA不是應(yīng)該有一部分跑在下面嗎？有沒有誰做過類似的實(shí)驗(yàn)？遇到類似的現(xiàn)象？怎么解釋？

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1樓 2014-05-09 16:47:45

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jamy1989(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-05-10 08:26:48
jamy1989: 金幣+5, ★有幫助 2014-05-10 14:00:43

這個(gè)還算常見。probe彌散了。你要做更細(xì)的比例梯度，尋找合適的點(diǎn)。

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2樓2014-05-10 00:47:29

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【答案】應(yīng)助回帖

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EMSA做起來很麻煩，建議采用DPI-ELISA

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3樓2014-05-10 07:24:09

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引用回帖:

2樓: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-10 00:47:29
這個(gè)還算常見。probe彌散了。你要做更細(xì)的比例梯度，尋找合適的點(diǎn)。

我做了蛋白濃度梯度的EMSA，在蛋白濃度低的時(shí)候是會(huì)出現(xiàn)探針彌散，蛋白濃度高時(shí)探針就不會(huì)彌散，上面這個(gè)圖是用高濃度蛋白做的，3號(hào)條帶只是變淡了，能算彌散嗎？

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4樓2014-05-10 14:03:06

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jamy1989: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-05-11 08:28:03

引用回帖:

4樓: Originally posted by jamy1989 at 2014-05-10 14:03:06
我做了蛋白濃度梯度的EMSA，在蛋白濃度低的時(shí)候是會(huì)出現(xiàn)探針彌散，蛋白濃度高時(shí)探針就不會(huì)彌散，上面這個(gè)圖是用高濃度蛋白做的，3號(hào)條帶只是變淡了，能算彌散嗎？...

probe彌散反應(yīng)了一種probe-protein的中間狀態(tài)，還是那么多probe，但是分布在很大范圍之后，就會(huì)顯得很弱。EMSA做的就是protein-polynucleotide的比例關(guān)系，你蛋白濃度低的時(shí)候能出現(xiàn)彌散，提高了蛋白就好了，等于提高了蛋白：核酸比例，競(jìng)爭(zhēng)的時(shí)候加入競(jìng)爭(zhēng)probe，不就等于降低蛋白：核酸比例么？

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5樓2014-05-10 19:03:20

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5樓: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-10 19:03:20
probe彌散反應(yīng)了一種probe-protein的中間狀態(tài)，還是那么多probe，但是分布在很大范圍之后，就會(huì)顯得很弱。EMSA做的就是protein-polynucleotide的比例關(guān)系，你蛋白濃度低的時(shí)候能出現(xiàn)彌散，提高了蛋白就好了，等于提 ...

首先，謝謝你，你說的很有道理！你比較一下我那2,3,4號(hào)條帶，它的寬細(xì)都差不多，應(yīng)該不算彌散吧，蛋白濃度低時(shí)，條帶就很寬，明顯很散的樣子，但這個(gè)好像就是亮度變淡了，會(huì)不會(huì)是加入競(jìng)爭(zhēng)性DNA后，有一部分標(biāo)記的DNA沒有進(jìn)入凝膠呢？

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6樓2014-05-11 08:27:52

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jamy1989: 金幣+4, ★★★很有幫助 2014-05-11 21:28:33

引用回帖:

6樓: Originally posted by jamy1989 at 2014-05-11 08:27:52
首先，謝謝你，你說的很有道理！你比較一下我那2,3,4號(hào)條帶，它的寬細(xì)都差不多，應(yīng)該不算彌散吧，蛋白濃度低時(shí)，條帶就很寬，明顯很散的樣子，但這個(gè)好像就是亮度變淡了，會(huì)不會(huì)是加入競(jìng)爭(zhēng)性DNA后，有一部分標(biāo)記的 ...

我遇到的彌散，并不是說是寬度的變化，而是分布在泳道上下很大的范圍，比如從free-probe到shift之間，因?yàn)樵谶@種蛋白：核酸比例下，形成了很多中間狀態(tài)的complex，分布在泳道大小不同的位置，導(dǎo)致信號(hào)顯得丟失了。
至于是不是沒有入孔，或者是不是這一管probe壓根就給少了，這更多的是操作上面的問題，空說無憑了，你要自己control，實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)。

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7樓2014-05-11 14:18:16

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7樓: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-11 14:18:16
我遇到的彌散，并不是說是寬度的變化，而是分布在泳道上下很大的范圍，比如從free-probe到shift之間，因?yàn)樵谶@種蛋白：核酸比例下，形成了很多中間狀態(tài)的complex，分布在泳道大小不同的位置，導(dǎo)致信號(hào)顯得丟失了。 ...

你好，之前發(fā)了幾個(gè)重復(fù)的帖子，總是沒看到圖片，后來發(fā)現(xiàn)是電腦的問題。還是請(qǐng)你看下剛發(fā)的帖子“EMSA競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)和蛋白梯度試驗(yàn)”。上面你提到的，蛋白核酸分布在泳道大小不同的位置，導(dǎo)致信號(hào)顯得丟失了，這個(gè)丟失是指DNA擴(kuò)散到膠的不同位置，濃度太低，以至于顯色時(shí)沒顯出來嗎？還有沒有入孔，我的意思是一部分標(biāo)記的DNA點(diǎn)到膠孔里，但是跑膠沒有進(jìn)入到凝膠里，以至于轉(zhuǎn)膜時(shí)標(biāo)記的總DNA變少，會(huì)不會(huì)有這種可能？至于probe就給少了應(yīng)該不可能，量的操作應(yīng)該沒什么問題！

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8樓2014-05-11 21:28:28

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cathy77yy

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hello，你的EMSA做成功了嗎

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9樓2014-10-11 00:22:47

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9樓: Originally posted by cathy77yy at 2014-10-11 00:22:47
hello，你的EMSA做成功了嗎

成功了啊！

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10樓2014-10-11 21:02:11

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