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碧螺春晴金蟲 (正式寫手)
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[求助]
關(guān)于western顯影是出的兩個(gè)問題，求教�。。�！ 已有2人參與
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各位高手有木有人做western時(shí)遇到這樣的問題啊，就是在調(diào)β-actin的時(shí)候在目標(biāo)條帶下方出現(xiàn)了很黑的非特異性條帶。最惡心的時(shí)熒光的時(shí)間非常的短，往往我在顯第二個(gè)片的時(shí)候有些條帶就變的很淺了，雖然熒光不會一直有但是也不會這么快就滅了吧，之前就很正常的。我想請教一下各位高手這是哪個(gè)環(huán)節(jié)出了問題啊。是發(fā)光劑出了問題么。 人家是新蟲沒有太多的金幣，大家?guī)蛶兔β? |
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李小冬2
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1。ECL顯影液失效，用二抗和ECL接觸檢查， 2.二抗孵育后洗膜用TTBS?、最后用TBS洗兩遍，吐溫對ECL顯色有影響。 3.保鮮膜不干凈（我覺得應(yīng)該不是這個(gè)問題） 4.非特異性條帶，第一是蛋白降解嚴(yán)重，在提取蛋白和制作上樣液是注意加入蛋白酶抑制劑，第二是 一抗?jié)舛忍�，我平�?：5000、二抗：1:5000.第三是，蛋白上樣液內(nèi)蛋白濃度太大，β-actin含量多很少的蛋白樣品就可以出來?xiàng)l帶，而且條帶之間更容易比較，我現(xiàn)在正在，試驗(yàn)沒孔4ug上樣液的結(jié)果。 |
2樓2014-05-16 21:14:15
junboliang
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3樓2014-05-17 10:50:42
碧螺春晴
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4樓2014-05-20 17:19:44
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