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一桶稀泥木蟲 (正式寫手)
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[求助]
克隆基因，總是少28bp 已有7人參與
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大家好，我克隆一個(gè)全長513bp的基因，連完載體菌液送測(cè)序總是少28bp，后來送PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)也是少28bp,從條帶上來看也看不出來，跑膠沒有不特異的條帶，有附圖；最后一張附圖是我截取的基因序列前面一部分，劃線部分是缺失的28bp,另外缺失序列后面緊接著的28bp只有一個(gè)堿基不同，會(huì)不會(huì)測(cè)序有什么影響，另外缺失的堿基數(shù)不是3的倍數(shù)，很奇怪？謝謝大俠們了 PCR全長.jpg 酶切（ECOR1）.jpg 基因部分序列.jpg |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 重復(fù)序列PCR擴(kuò)增 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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一桶稀泥(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-05-29 13:10:25
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如果從不同品種來源的基因組，那很可能存在等位變異，因此可以從不同品種或不同基因型的黃瓜中克隆你的目的基因。 是否單拷貝可以如你所說的做，既然黃瓜基因組都測(cè)序完成，那這個(gè)基因應(yīng)該很好查到定位的。也可以參考其它物種這個(gè)基因的相關(guān)研究。（拿到基因一般都要在NCBI里搜索一番，看看相關(guān)序列，然后做個(gè)系統(tǒng)分析，預(yù)測(cè)一下基因功能啥的。） 你的基因如果編碼區(qū)真缺失了28bp，除非是不編碼蛋白的基因，或者在內(nèi)含子區(qū)，否則就是個(gè)假基因了吧。 如果重復(fù)PCR都缺失28bp，那就不是PCR問題了。  都不知道你的模板是基因組還是cDNA，如果cDNA就不存在內(nèi)含子的因素了。 |
15樓2014-05-28 12:49:18
萬麗麗081222
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gyesang
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一桶稀泥: 金幣+2, ★★★很有幫助 2014-10-08 22:24:51
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這個(gè)問題無解，原因就是里面有個(gè)repeat,感覺當(dāng)有兩個(gè)repeat的時(shí)候，做PCR會(huì)跳過一個(gè)似的，不知道什么原因 這個(gè)問題我也遇到過，我克隆SV40的啟動(dòng)子，SV40啟動(dòng)子里面有個(gè)增強(qiáng)子，兩個(gè)72bp的重復(fù)，做PCR，就是只能獲得一個(gè)72bp，另外一個(gè)的repeat就是擴(kuò)增不到 |
6樓2014-05-27 14:17:20
gyesang
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一桶稀泥(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-05-29 13:10:40
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感覺你是想克隆這個(gè)基因做表達(dá)用的，你這個(gè)基因528bp不長，獲得該基因除了從以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增外，也可以去進(jìn)行全基因合成 鑒于你這個(gè)問題，如果你實(shí)在是想通過自己分子克隆方法來解決這個(gè)重復(fù)序列PCR丟失問題也是可以的，不過比較復(fù)雜(不推薦這么做，技術(shù)上是可行的)，你可以從重復(fù)片段處分為上下兩段，通過引入IIs限制性內(nèi)切酶,如BsaI,BbsI等，分別回收PCR克隆前后兩個(gè)片段，然后再通過限制性酶切將兩個(gè)片段連接在一起。 |
18樓2014-05-28 17:49:26
一桶稀泥
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10樓2014-05-28 00:09:37
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