 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 6016 | 回復: 4 | ||||
wang_zhen銅蟲 (小有名氣)
|
[求助]
求20%Native-PAGE膠的配方，緩沖液成分 已有1人參與
|
| 各位大神，求20%Native-PAGE膠的配方，緩沖液成分，跑30bpDNA |
回復此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有125人回復
-
蛋白質檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復
» 本主題相關價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 【電泳求助】Lysozyme條帶不顯示
已經(jīng)有1人回復
- 跪求英語高手幫忙翻譯，多謝各位大俠！
已經(jīng)有1人回復
飛約瘋人院
專家顧問 (著名寫手)
科學怪人
-
專家經(jīng)驗: +140 - MolEPI: 2
- 應助: 308 (大學生)
- 金幣: 1079.5
- 散金: 8294
- 紅花: 65
- 沙發(fā): 5
- 帖子: 1996
- 在線: 266.1小時
- 蟲號: 3188421
- 注冊: 2014-05-07
- 專業(yè): 生物化學
- 管轄: 分子生物
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-27 22:55:45
wang_zhen: 金幣+10, ★★★很有幫助, 謝謝你的回答 2014-05-28 09:15:15
感謝參與，應助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-27 22:55:45
wang_zhen: 金幣+10, ★★★很有幫助, 謝謝你的回答 2014-05-28 09:15:15
|
方案1， 30%Acr-Bis: 6.6mL 1M Tris,pH8.8: 3.2mL 10%SDS： 0.05mL 10%過硫酸銨：0.05mL TEMED： 0.002mL 方案2，先自行配制1.1875M Tris,pH8.8 30%Acr-Bis: 6.6mL 1.1875M Tris,pH8.8: 3.2mL 10%SDS： 0.05mL 10%過硫酸銨：0.05mL TEMED： 0.002mL 如果不凝，則10%APS用0.1mL,TEMED用0.01mL. |
2樓2014-05-27 22:30:26
wang_zhen
銅蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 805.5
- 帖子: 161
- 在線: 198.1小時
- 蟲號: 1673594
- 注冊: 2012-03-07
- 性別: MM
- 專業(yè): 計算機網(wǎng)絡
3樓2014-05-27 22:53:49
飛約瘋人院
專家顧問 (著名寫手)
科學怪人
-
專家經(jīng)驗: +140 - MolEPI: 2
- 應助: 308 (大學生)
- 金幣: 1079.5
- 散金: 8294
- 紅花: 65
- 沙發(fā): 5
- 帖子: 1996
- 在線: 266.1小時
- 蟲號: 3188421
- 注冊: 2014-05-07
- 專業(yè): 生物化學
- 管轄: 分子生物
|
工作液配制 1. 40%膠貯液(Acr:Bis=29：1）； 2. 4X分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)： 18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用濃HCl調pH 8.8，加水定容到100ml，4℃ 貯存； 3. 4X堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)： 6 g Trisbase 溶于80ml 水，用濃HCl調pH 6.8，加水定容到100ml，4℃ 貯存；' 4. 10X電泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1L，4℃ 貯存； 5. 2溴酚藍上樣Buf: 1.25 ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚藍，5.5ml dH2O； -20℃貯存； 6. 10％APS； 7. 0.25％考馬斯亮藍染色液: Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml； 8. 考馬斯亮藍脫色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O 或者 50ml乙醇，100冰醋酸，850ml dH2O 電泳膠的配制及電泳條件（上槽電極為負，下槽電極為正） 1. 堿性非變性膠 17%分離膠(10 ml) 4%堆積膠(5 ml) 2. 40%膠貯液(40%T,3.3%C） 4.2ml 0.5ml 3. 4X分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8） 2.5ml 4. 4X堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml 5. 水 3.2ml 6. 10％APS 100μl 50μl 7. TEMED 10 μl 5μl 8. 10X電泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀釋到1L 電泳條件 : 100V恒壓約20min，指示劑進入濃縮膠；改換160V恒壓，當指示劑移動到膠板底部時，停止電泳，整個過程約80min。 染色和脫色:取出膠板于0.25％考馬斯亮藍染色液中染色約30min，傾出染色液，加入考馬斯亮藍脫色液，緩慢搖動，注意更換脫色液，直至膠板干凈清晰背景。 也可以用銀染或者活性染色。 分離堿性蛋白 要用低pH凝膠系統(tǒng)，并使用以下緩沖液體系： 1. 分離膠：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）； 2. 堆積膠：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）； ` 3. 電泳緩沖液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5 將正負電極倒置，用甲基綠（0.002%）為示蹤劑: 實驗操作同分離酸性蛋白。 回收 native-PAGE結束以后，采用電泳的方法進行回收，方法如下 電泳結束以后，切取部分染色，然后根據(jù)染色結果切取含有蛋白質的膠帶裝入處理過的透析袋中，加入適量的緩沖液，最后把透析袋放入普通的核酸電泳槽中，并在電泳槽中加入適量的緩沖液（和透析袋中的緩沖液相同），低溫電泳2-3小時即可。回收蛋白所用的緩沖液一般和電泳所用的緩沖液相同。 Native-PAGE注意事項 1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中，蛋白質的遷移率不僅和蛋白質的等電點有關，還和蛋白質的分子量以及分子形狀有關，其中蛋白質的等電點是最重要的影響因子，要根據(jù)蛋白質的等電點來選擇對應的電泳緩沖系統(tǒng) 2. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中，要注意電壓過高引起發(fā)熱而導致蛋白質變性，所以最好在電泳槽外面放置冰塊以降低溫度； 3. 蛋白質的分子量較大，則電泳時間可以適當延長，以使目的蛋白質有足夠的遷移率和其它的蛋白質分開，反之亦然; 4. 變性樣品的離子強度不能太高（I<0.1mM）。調整樣品的PH在4.0左右，這對于能否做好非變性樣品非常重要。上樣BUFFER 中沒有SDS之外，加入樣品后不能加熱。 Native-PAGE和SDS-PAGE的比較 非變性凝膠電泳，也稱為天然凝膠電泳，與非變性凝膠電泳最大的區(qū)別就在于蛋白在電泳過程中和電泳后都不會變性。最主要的有以下幾點：) 1. 凝膠的配置中非變性凝膠不能加入SDS，而變性凝膠的有SDS。. 2. 電泳載樣緩沖液中非變性凝膠的不僅沒有SDS，也沒有巰基乙醇。 3. 在非變性凝膠中蛋白質的分離取決于它所帶的電荷以及分子大小，不像SDS-PAGE電泳中蛋白質分離只與其分子量有關。 4. 非變性凝膠電泳中，酸性蛋白和堿性蛋白的分離是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正極泳動。非變性凝膠電泳中堿性蛋白通常是在微酸性環(huán)境下進行，蛋白帶正電荷，需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。 5. 因為是非變性凝膠電泳，所有的電泳時候電流不能太大，以免電泳時產生的熱量太多導致蛋白變性，而且步驟都要在0-4度的條件下進行，這樣才可以保持蛋白質的活性，也可以降低蛋白質的水解作用。這點跟變性電泳也不一樣。 |
4樓2014-05-27 22:56:23
5樓2015-08-26 17:19:43
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 wang_zhen 的主題更新
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 294求調劑材料與化工專碩 +5 | 陌の森林 2026-03-18 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 一志愿華中科技大學，080502，354分求調劑 +4 | 守候夕陽CF 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 344求調劑 +6 | knight344 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿武理材料305分求調劑 +5 | 想上岸的鯉魚 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
[教師之家] 焦慮 +8 | 水冰月月野兔 2026-03-13 | 12/600 |
|
|
|
[考博] 環(huán)境領域全國重點實驗室招收博士1-2名 +3 | QGZDSYS 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學336分求調劑 +6 | zbzihdhd 2026-03-15 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 275求調劑 +4 | 太陽花天天開心 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 333求調劑 +3 | 文思客 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0854控制工程 359求調劑 可跨專業(yè) +3 | 626776879 2026-03-14 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0703一志愿211 285分求調劑 +5 | ly3471z 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 326求調劑 +3 | mlpqaz03 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求老師收留調劑 +4 | jiang姜66 2026-03-14 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 中科大材料專碩319求調劑 +3 | 孟鑫材料 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 學碩285求調劑 +13 | Wisjxn 2026-03-12 | 46/2300 |
|
|
|
[考研] 0856材料與化工301求調劑 +5 | 奕束光 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[碩博家園] 085600 260分求調劑 +3 | 天空還下雨么 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 工科278分求調劑 +5 | 周慢熱啊 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 309分請求調劑 +7 | dtdxzxx 2026-03-12 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 070303一志愿西北大學學碩310找調劑 +3 | d如愿上岸 2026-03-13 | 3/150 |
|