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wang_zhen銅蟲 (小有名氣)
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工作液配制 1. 40%膠貯液(Acr:Bis=29：1）； 2. 4X分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)： 18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用濃HCl調(diào)pH 8.8，加水定容到100ml，4℃ 貯存； 3. 4X堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)： 6 g Trisbase 溶于80ml 水，用濃HCl調(diào)pH 6.8，加水定容到100ml，4℃ 貯存；' 4. 10X電泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1L，4℃ 貯存； 5. 2溴酚藍(lán)上樣Buf: 1.25 ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚藍(lán)，5.5ml dH2O； -20℃貯存； 6. 10％APS； 7. 0.25％考馬斯亮藍(lán)染色液: Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml； 8. 考馬斯亮藍(lán)脫色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O 或者 50ml乙醇，100冰醋酸，850ml dH2O 電泳膠的配制及電泳條件（上槽電極為負(fù)，下槽電極為正） 1. 堿性非變性膠 17%分離膠(10 ml) 4%堆積膠(5 ml) 2. 40%膠貯液(40%T,3.3%C） 4.2ml 0.5ml 3. 4X分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8） 2.5ml 4. 4X堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml 5. 水 3.2ml 6. 10％APS 100μl 50μl 7. TEMED 10 μl 5μl 8. 10X電泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀釋到1L 電泳條件 : 100V恒壓約20min，指示劑進(jìn)入濃縮膠；改換160V恒壓，當(dāng)指示劑移動(dòng)到膠板底部時(shí)，停止電泳，整個(gè)過程約80min。 染色和脫色:取出膠板于0.25％考馬斯亮藍(lán)染色液中染色約30min，傾出染色液，加入考馬斯亮藍(lán)脫色液，緩慢搖動(dòng)，注意更換脫色液，直至膠板干凈清晰背景。 也可以用銀染或者活性染色。 分離堿性蛋白 要用低pH凝膠系統(tǒng)，并使用以下緩沖液體系： 1. 分離膠：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）； 2. 堆積膠：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）； ` 3. 電泳緩沖液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5 將正負(fù)電極倒置，用甲基綠（0.002%）為示蹤劑: 實(shí)驗(yàn)操作同分離酸性蛋白。 回收 native-PAGE結(jié)束以后，采用電泳的方法進(jìn)行回收，方法如下 電泳結(jié)束以后，切取部分染色，然后根據(jù)染色結(jié)果切取含有蛋白質(zhì)的膠帶裝入處理過的透析袋中，加入適量的緩沖液，最后把透析袋放入普通的核酸電泳槽中，并在電泳槽中加入適量的緩沖液（和透析袋中的緩沖液相同），低溫電泳2-3小時(shí)即可。回收蛋白所用的緩沖液一般和電泳所用的緩沖液相同。 Native-PAGE注意事項(xiàng) 1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中，蛋白質(zhì)的遷移率不僅和蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有關(guān)，還和蛋白質(zhì)的分子量以及分子形狀有關(guān)，其中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是最重要的影響因子，要根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)來選擇對(duì)應(yīng)的電泳緩沖系統(tǒng) 2. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中，要注意電壓過高引起發(fā)熱而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，所以最好在電泳槽外面放置冰塊以降低溫度； 3. 蛋白質(zhì)的分子量較大，則電泳時(shí)間可以適當(dāng)延長(zhǎng)，以使目的蛋白質(zhì)有足夠的遷移率和其它的蛋白質(zhì)分開，反之亦然; 4. 變性樣品的離子強(qiáng)度不能太高（I<0.1mM）。調(diào)整樣品的PH在4.0左右，這對(duì)于能否做好非變性樣品非常重要。上樣BUFFER 中沒有SDS之外，加入樣品后不能加熱。 Native-PAGE和SDS-PAGE的比較 非變性凝膠電泳，也稱為天然凝膠電泳，與非變性凝膠電泳最大的區(qū)別就在于蛋白在電泳過程中和電泳后都不會(huì)變性。最主要的有以下幾點(diǎn)：) 1. 凝膠的配置中非變性凝膠不能加入SDS，而變性凝膠的有SDS。. 2. 電泳載樣緩沖液中非變性凝膠的不僅沒有SDS，也沒有巰基乙醇。 3. 在非變性凝膠中蛋白質(zhì)的分離取決于它所帶的電荷以及分子大小，不像SDS-PAGE電泳中蛋白質(zhì)分離只與其分子量有關(guān)。 4. 非變性凝膠電泳中，酸性蛋白和堿性蛋白的分離是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正極泳動(dòng)。非變性凝膠電泳中堿性蛋白通常是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷，需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。 5. 因?yàn)槭欠亲冃阅z電泳，所有的電泳時(shí)候電流不能太大，以免電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量太多導(dǎo)致蛋白變性，而且步驟都要在0-4度的條件下進(jìn)行，這樣才可以保持蛋白質(zhì)的活性，也可以降低蛋白質(zhì)的水解作用。這點(diǎn)跟變性電泳也不一樣。 |
4樓2014-05-27 22:56:23
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-27 22:55:45
wang_zhen: 金幣+10, ★★★很有幫助, 謝謝你的回答 2014-05-28 09:15:15
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方案1， 30%Acr-Bis: 6.6mL 1M Tris,pH8.8: 3.2mL 10%SDS： 0.05mL 10%過硫酸銨：0.05mL TEMED： 0.002mL 方案2，先自行配制1.1875M Tris,pH8.8 30%Acr-Bis: 6.6mL 1.1875M Tris,pH8.8: 3.2mL 10%SDS： 0.05mL 10%過硫酸銨：0.05mL TEMED： 0.002mL 如果不凝，則10%APS用0.1mL,TEMED用0.01mL. |
2樓2014-05-27 22:30:26
wang_zhen
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3樓2014-05-27 22:53:49
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