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pxyboy金蟲 (小有名氣)
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[求助]
請(qǐng)蟲友幫我看下論文二審的意見 已有2人參與
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前段時(shí)間投了一篇2分多的sci雜志，文章其中一塊內(nèi)容是用pUC19載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，插入失活乳酸菌的一段基因。結(jié)果其中一個(gè)評(píng)審人對(duì)結(jié)果提了疑問(wèn)，主要是對(duì)插入失活的基因片段是否真正整合到基因組上了有疑問(wèn)，讓我提交確實(shí)的證據(jù)，然后我第一次回復(fù)他的時(shí)候，把野生型菌和工程菌提基因組后分別擴(kuò)增目的基因，通過(guò)二者片段大小不一致（工程菌長(zhǎng)度多了段插入的抗性基因）來(lái)支持我的論文。結(jié)果又返回來(lái)二修的意見，還是這個(gè)評(píng)審人有疑問(wèn)，仍然是對(duì)這個(gè)問(wèn)題有疑問(wèn)，具體如下，請(qǐng)戰(zhàn)友幫我一下，如何回復(fù)這個(gè)評(píng)審人，先謝過(guò)了！ The authors haveaddressed my concern about the missing proof for a true knock-out with a newPCR based experiment, showing basically two bands from wildtype and mutant,differing by the size of the Erythromycin gene insert. However, for a fulldesciption of the mutant construction some point are still missing: First,can the authors verify that the plasmid is not replicating in the host strain?The cited literature does not provide this information, so a citation whichstates that ColE1 type replicons cannot replicate in Lactobacillus would benecessary. If this is not clear from the literature, additional experimentwould be needed to verify this. Second, and related to the first point, usuallythe first step of a knock-out generation is the formation of a merodiploidafter a first homologous recombination, integrating the whole plasmid into thegenome. Usually a counterselection via a suicide gene on the plasmid is used,to select the true mutants from the merodiploids. This was obviously not donein this case, so the question remains, if the resulting strain is a knock-outor a merodiploid. A very easy test would be to screen the mutants for the presenceof the Amp gene, which is on the plasmid and would be gone in a true mutant. Third, for characterization of a mutant, acomplementation experiment is necessary, to exclude downstream effects of theintroduced knock-out gene (EryR) on other genes. In this case a merodiploidwould be usful as here one intact copy of the gene is present followed by theintegrated plasmid, so downstream effects should be visible in a merodiploidwhile an effect of the gene knock-out should not be visible. Alternatively theauthors can perhaps use their pMG76e-mur plasmid to create a complementedmutant. In any case this complemented mutant should be included in thephenotypic testing and should behave more or less like the wildtype to provethat the observed effect is really due to the knock-out of the mur gene aloneand nothing else plays a role for the observed phenotype. |
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2樓2014-05-28 11:18:51
朱多龍
木蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
pxyboy: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 對(duì)我?guī)椭艽�，謝謝 2014-05-29 14:49:51
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1 確定使用pUC19構(gòu)建的載體可以在乳酸菌中用于打靶？不能再乳酸菌中復(fù)制嗎？貌似我還沒見過(guò)以pUC19做為基礎(chǔ)質(zhì)粒用于構(gòu)建乳酸菌基因敲除載體的。可以pcr擴(kuò)增后測(cè)序。 2 需要把單交換到雙交換這一步篩選的過(guò)程詳細(xì)描述出來(lái)。 3 回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)必須要做。紅霉素的正篩標(biāo)簽沒刪去，是否會(huì)影響菌株的一些其它基因正常表達(dá)呢？是否由于紅霉素的原因造成的？所以必須回補(bǔ)敲除基因。如果可以，最好把ery基因拿下。 |
3樓2014-05-28 13:07:02
pxyboy
金蟲 (小有名氣)
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4樓2014-05-29 14:49:08
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