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austin2008鐵桿木蟲 (著名寫手)
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[求助]
能在芽孢桿菌中復(fù)制的溫敏型復(fù)制子194ts片段連接T載體多次測序都發(fā)生突變 已有1人參與
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問題描述：本人想構(gòu)建一個溫敏型的穿梭質(zhì)粒，在NCBI上找到pE194質(zhì)粒上的復(fù)制子序列194ts（GenBank: M17811.1），然后送到蘇州某公司合成1138 bp 的片段，結(jié)果該公司兩次裝載pUC57載體失敗，主要是原因是，這個片段裝到pUC57載體中總是發(fā)生各種突變，他們測序了7個克隆子后測序發(fā)現(xiàn)2個雙峰，5個突變，而且每個突變的突變位置都不一樣，最終提供給我們的是合成的組裝好的PCR產(chǎn)物和空的pUC57載體，給我們的解釋是我們合成的194ts片段是個復(fù)制子可能會與載體上大腸桿菌的ori發(fā)生沖突，復(fù)制過程中產(chǎn)生突變。我當(dāng)時對這個解釋是將信將疑，等拿到材料了準(zhǔn)備驗(yàn)證一下，無論是我們連接pMD19T simple載體還是pUC57載體，做了3次，每次送3-4個陽性克隆子去測序，結(jié)果每次都有突變，而且每次突變的點(diǎn)不一樣，我們將這些突變的溫敏復(fù)制子酶切后，連入穿梭載體替換芽孢桿菌的復(fù)制區(qū)域，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化2次枯草芽孢桿菌，每一種都沒有長出陽性克隆子（注：對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化長了，枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞沒問題）。 我個人分析了一下，可能有以下2種原因：（1）這個溫敏型復(fù)制子194ts連入T載體質(zhì)粒不穩(wěn)定，可能是連入的方向不好；（2）大腸桿菌的ori和這個194ts片段在一個載體中時在質(zhì)粒復(fù)制過程中出現(xiàn)問題；問了好些做分子生物學(xué)的人都不知道其中出了什么問題，請了解情況的高手賜教，不勝感激……！ |
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austin2008
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5樓2015-01-08 17:06:42
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