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[求助]
雙酶切總是切不開。。。有沒有人用過NEB的NotI這個酶？ 已有10人參與
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各位同學 我這兩個禮拜一只在用NOtI和sfiI這兩個酶雙酶切載體，但是一直都切不太出來。為了找出是哪個酶的問題，我是這樣做的： 在一號管中加入酶切體系和NOTI酶，37度7個小時，電泳檢測，發(fā)現(xiàn)酶切后的帶和未酶切的帶大小相同。說明酶切不成功。 在二號管中加入酶切體系和sfiI酶，50度過夜。電泳檢測，酶切后的帶比未酶切的帶遷移的慢，說明已經(jīng)成功切開了。 切片段的時候，是在以上同樣的條件下（notI酶37度7個小時，再加sfiI酶50度過夜），電泳檢測是正確的。 注：這兩個酶用的都是NEB的，所用的buffer是一樣的，都是一個叫cutsmart的buffer。說明書上寫的是notI酶37度酶切15-20分鐘，sfiI酶50度酶切15-20分鐘。 各位高手知不知道這是怎么回事啊 急求幫助啊 這個NOTI賊貴賊貴的，用不起了�。。。。。。。。。。�！ |
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鬼羽帝魂
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gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖交流！ 2014-07-15 15:23:19
gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖交流！ 2014-07-15 15:23:19
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1.“在一號管中加入酶切體系和NOTI酶，37度7個小時，電泳檢測，發(fā)現(xiàn)酶切后的帶和未酶切的帶大小相同。說明酶切不成功�！� 你的載體上只有一個NotI的酶切位點，搜易應該是線性化的，只有一條帶，你提的質粒應該有2-3條帶，如果切了以后只有一條帶，就說明已經(jīng)切開了。 2.“在二號管中加入酶切體系和sfiI酶，50度過夜。電泳檢測，酶切后的帶比未酶切的帶遷移的慢，說明已經(jīng)成功切開了�！� 其實看酶切有沒有完全的時候，這樣做不太好。最好是比較提的質粒有2-3條帶，酶切后的有1條帶比較好。 一般提質粒都有2-3條帶的，試劑盒提質粒的話就不好說了，試劑盒提出來好像是一條帶。 |
37樓2014-06-27 10:40:20
鬼羽帝魂
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2樓2014-06-20 15:30:51
3樓2014-06-20 15:36:43
4樓2014-06-20 15:50:08
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