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seven拂曉

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[求助] 雙酶切總是切不開(kāi)。。。有沒(méi)有人用過(guò)NEB的NotI這個(gè)酶？已有10人參與

各位同學(xué)
我這兩個(gè)禮拜一只在用NOtI和sfiI這兩個(gè)酶雙酶切載體，但是一直都切不太出來(lái)。為了找出是哪個(gè)酶的問(wèn)題，我是這樣做的：
在一號(hào)管中加入酶切體系和NOTI酶，37度7個(gè)小時(shí)，電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)酶切后的帶和未酶切的帶大小相同。說(shuō)明酶切不成功。
在二號(hào)管中加入酶切體系和sfiI酶，50度過(guò)夜。電泳檢測(cè)，酶切后的帶比未酶切的帶遷移的慢，說(shuō)明已經(jīng)成功切開(kāi)了。

切片段的時(shí)候，是在以上同樣的條件下（notI酶37度7個(gè)小時(shí)，再加sfiI酶50度過(guò)夜），電泳檢測(cè)是正確的。
注：這兩個(gè)酶用的都是NEB的，所用的buffer是一樣的，都是一個(gè)叫cutsmart的buffer。說(shuō)明書(shū)上寫(xiě)的是notI酶37度酶切15-20分鐘，sfiI酶50度酶切15-20分鐘。

各位高手知不知道這是怎么回事啊急求幫助啊這個(gè)NOTI賊貴賊貴的，用不起了�。。。。。。。。。。�！

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1樓 2014-06-20 15:09:11

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seven拂曉: 金幣+10 2014-06-21 23:39:30

NOtI 的酶切效果受CG methylase導(dǎo)致的DNA甲基化的影響，嚴(yán)重影響

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我存在

4樓2014-06-20 15:50:08

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曾文正公

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非常討厭notI這個(gè)酶建議換個(gè)酶切位點(diǎn) 用其他酶

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7樓2014-06-20 20:55:42

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seven拂曉(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-06-22 12:35:43

引用回帖:

23樓: Originally posted by seven拂曉 at 2014-06-21 23:36:02
用的是not1-hf
你的意思是先用not1切，然后pcr回收，再用sfi切？
先用not1還是先用sfi有區(qū)別嗎...

都可以的不過(guò)建議先用sfiI切因?yàn)槟阗|(zhì)粒加的很多而根據(jù)你之前的實(shí)驗(yàn) 這個(gè)酶不太可能有問(wèn)題然后再用notI切回收的產(chǎn)物(回收產(chǎn)物的量少) 這樣更能消除不確定因素

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只有非常努力，才能看起來(lái)毫不費(fèi)力

26樓2014-06-22 12:09:33

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鬼羽帝魂

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NOTI酶按理說(shuō)挺好切的啊，TAKARA的就很好切。你的1ug質(zhì)粒加了多少酶？試試多加一點(diǎn)切切看。

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2樓2014-06-20 15:30:51

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2樓: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-06-20 15:30:51
NOTI酶按理說(shuō)挺好切的啊，TAKARA的就很好切。你的1ug質(zhì)粒加了多少酶？試試多加一點(diǎn)切切看。

我沒(méi)有測(cè)質(zhì)粒濃度，50ul的體系加了1ul的酶，30ul的質(zhì)粒，質(zhì)粒是比較多，可是總得有一部分切開(kāi)的吧。電泳顯示就一條單一的帶

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3樓2014-06-20 15:36:43

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4樓: Originally posted by 554526385 at 2014-06-20 15:50:08
NOtI 的酶切效果受CG methylase導(dǎo)致的DNA甲基化的影響，嚴(yán)重影響

不太懂甲基化，剛才百度了下，還是不太明白，請(qǐng)問(wèn)質(zhì)粒也會(huì)甲基化嗎

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5樓2014-06-20 16:10:51

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你如果是切空載體，少用點(diǎn)質(zhì)粒效果好，還有，你判斷是否切開(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)貌似不對(duì)，容易誤判

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6樓2014-06-20 20:08:58

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分步切試試，not1貴呀，要珍惜。

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8樓2014-06-20 21:21:44

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6樓: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-20 20:08:58
你如果是切空載體，少用點(diǎn)質(zhì)粒效果好，還有，你判斷是否切開(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)貌似不對(duì)，容易誤判

那應(yīng)該以什么標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷呢 1ul的酶切多少u(mài)l的載體呢

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9樓2014-06-20 21:52:18

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7樓: Originally posted by 曾文正公 at 2014-06-20 20:55:42
非常討厭notI這個(gè)酶建議換個(gè)酶切位點(diǎn) 用其他酶

這個(gè)破載體不是商業(yè)化的就兩個(gè)酶切位點(diǎn)。。。。

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10樓2014-06-20 21:52:50

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