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shuiniu87987銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
Takara的BamHI和XhoI雙酶切求助 已有2人參與
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| 最近酶切連接轉(zhuǎn)化后一直沒菌落，請(qǐng)大家看看問題出在哪？ 50微升雙酶切體系：通用buffer 是10乘K buffer 5微升，BamHI和XhoI各加2.5微升，質(zhì)粒2微克，加水至50微升。然后37度2小時(shí)，30度兩小時(shí)，結(jié)束。請(qǐng)問大家Buffer是不是加少了，還是Takara的酶效率不高，需要延長酶切時(shí)間？酶切跑電泳條帶后的質(zhì)粒和目的片段條帶均清晰。連接用的Takara的T4連接酶，16度連接10h，25微升體系，摩爾比是1:6，說明書要求分別是0.3pmol和0.03pmol，轉(zhuǎn)化為質(zhì)量大概是200ng（目的片段）和100ng（質(zhì)粒），我只加了80ng（目的片段）和50ng（質(zhì)粒），請(qǐng)問這會(huì)影響嗎？培養(yǎng)基和感受態(tài)均做過對(duì)照，沒問題。謝謝回答。 |
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youlinglyw
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2樓2014-05-08 22:52:56
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連接用的Takara的T4連接酶，16度連接10h，25微升體系，摩爾比是1:6，說明書要求分別是0.3pmol和0.03pmol，轉(zhuǎn)化為質(zhì)量大概是200ng（目的片段）和100ng（質(zhì)粒），我只加了80ng（目的片段）和50ng（質(zhì)粒），請(qǐng)問這會(huì)影響嗎？ 為什么不用Takara出的連接試劑盒呢，就比單買連接酶貴50塊吧，但效果是完全不一樣的。 |
3樓2014-05-08 23:20:26
shuiniu87987
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4樓2014-05-09 08:44:59
youlinglyw
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6樓2014-05-10 18:11:23
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7樓2014-05-10 19:47:23
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