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xuqingchun33銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
雙酶切體系是什么意思
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各位大俠，請問一下下面的這個雙酶切體系是什么意思？能否舉個例子，謝謝 Double Digestion with BamHI, NdeI We recommend: Buffer 2X Tango? 2-fold excess of BamHI 2-fold excess of NdeI Incubate at 37°C |
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2樓2011-07-02 15:26:07
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3樓2011-07-02 15:38:19
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good!講得很清楚了！ 2011-07-02 16:48:36
xuqingchun33(金幣+1): 2011-07-03 12:49:56
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good!講得很清楚了！ 2011-07-02 16:48:36
xuqingchun33(金幣+1): 2011-07-03 12:49:56
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一看就知道樓主用的是fermentas公司的限制性內(nèi)切酶。 Double Digestion with BamHI, NdeI就是選擇的酶是BamHI, NdeI。 We recommend: Buffer 2X Tango該公司推薦使用的酶切緩沖液是2X Tango，就是加酶切體系總體積的1/5的10X Tango。 2-fold excess of BamHI 2-fold excess of NdeI因為這兩個酶在2X Tango條件下活性都只有50-100%，不是100%，為了保證切割效率，所以加入的酶量是2倍。 Incubate at 37°C 這個就是酶切溫度了。 |
4樓2011-07-02 16:09:34
青菜小蟲
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5樓2011-07-02 17:17:28
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7樓2011-07-02 18:39:37
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
西瓜(金幣+3, EPI+1): 很有經(jīng)驗啊！酶的用量是可以省一些，大不了切久點就好了。很多酶在1X和2X tango中活性差別很大，可根據(jù)Fermentas那個表，用1X時就加總體積1/10的10X tango，用2X時就加1/5. 2011-07-02 21:02:51
xuqingchun33(金幣+1): 2011-07-03 12:50:07
西瓜(金幣+3, EPI+1): 很有經(jīng)驗啊！酶的用量是可以省一些，大不了切久點就好了。很多酶在1X和2X tango中活性差別很大，可根據(jù)Fermentas那個表，用1X時就加總體積1/10的10X tango，用2X時就加1/5. 2011-07-02 21:02:51
xuqingchun33(金幣+1): 2011-07-03 12:50:07
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放培養(yǎng)箱和水浴鍋沒有什么影響，只要保證在這個溫度下酶的效率是最大發(fā)揮的就沒有什么問題，有時候室內(nèi)溫度高，可以達(dá)到30幾度，照樣室溫進(jìn)行酶切； 另外buffer 2x tango,就是1/5的比例，就是總體積的五分之一，50ul體系的話添加10ul ，一般如果沒有特殊說明的話就是1/10,加5ul； 至于酶，也就是按照原體系量的二倍來加，因為兩種酶的活性在此條件和buffer下不是很高，很有可能是50%，比如50ul體系，加2ul，現(xiàn)在加4ul，其實個人認(rèn)為具體實驗中加2ul就可以了，不需要加那么多酶，浪費。。。 |
8樓2011-07-02 20:52:28
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