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xuqingchun33銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
雙酶切體系是什么意思
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各位大俠，請(qǐng)問(wèn)一下下面的這個(gè)雙酶切體系是什么意思？能否舉個(gè)例子，謝謝 Double Digestion with BamHI, NdeI We recommend: Buffer 2X Tango? 2-fold excess of BamHI 2-fold excess of NdeI Incubate at 37°C |
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2樓2011-07-02 15:26:07
shuifen1108
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3樓2011-07-02 15:38:19
lxj341401
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西瓜(金幣+5, EPI+1): Good!講得很清楚了！ 2011-07-02 16:48:36
xuqingchun33(金幣+1): 2011-07-03 12:49:56
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good!講得很清楚了！ 2011-07-02 16:48:36
xuqingchun33(金幣+1): 2011-07-03 12:49:56
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一看就知道樓主用的是fermentas公司的限制性內(nèi)切酶。 Double Digestion with BamHI, NdeI就是選擇的酶是BamHI, NdeI。 We recommend: Buffer 2X Tango該公司推薦使用的酶切緩沖液是2X Tango，就是加酶切體系總體積的1/5的10X Tango。 2-fold excess of BamHI 2-fold excess of NdeI因?yàn)檫@兩個(gè)酶在2X Tango條件下活性都只有50-100%，不是100%，為了保證切割效率，所以加入的酶量是2倍。 Incubate at 37°C 這個(gè)就是酶切溫度了。 |
4樓2011-07-02 16:09:34
青菜小蟲(chóng)
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+5): 鼓勵(lì)分享經(jīng)驗(yàn)。水浴這個(gè)缺點(diǎn)第一次聽(tīng)說(shuō)，學(xué)習(xí)了！ 2011-07-02 17:54:28
xuqingchun33(金幣+1): 2011-07-03 12:50:03
西瓜(金幣+5): 鼓勵(lì)分享經(jīng)驗(yàn)。水浴這個(gè)缺點(diǎn)第一次聽(tīng)說(shuō)，學(xué)習(xí)了！ 2011-07-02 17:54:28
xuqingchun33(金幣+1): 2011-07-03 12:50:03
| 我也用fermentas公司的限制性內(nèi)切酶。一般40ul 體系的話，10X Tango 8ul， BamHI, NdeI各0.8ul 。37°C放培養(yǎng)箱酶切過(guò)夜就可，或3-4小時(shí)，不建議水浴，因?yàn)殡x心管上下部溫度不一致，還造成揮發(fā)。 |
5樓2011-07-02 17:17:28
冼亮淀粉酶
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6樓2011-07-02 18:16:15
西瓜
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7樓2011-07-02 18:39:37
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+3, EPI+1): 很有經(jīng)驗(yàn)��！酶的用量是可以省一些，大不了切久點(diǎn)就好了。很多酶在1X和2X tango中活性差別很大，可根據(jù)Fermentas那個(gè)表，用1X時(shí)就加總體積1/10的10X tango，用2X時(shí)就加1/5. 2011-07-02 21:02:51
xuqingchun33(金幣+1): 2011-07-03 12:50:07
西瓜(金幣+3, EPI+1): 很有經(jīng)驗(yàn)��！酶的用量是可以省一些，大不了切久點(diǎn)就好了。很多酶在1X和2X tango中活性差別很大，可根據(jù)Fermentas那個(gè)表，用1X時(shí)就加總體積1/10的10X tango，用2X時(shí)就加1/5. 2011-07-02 21:02:51
xuqingchun33(金幣+1): 2011-07-03 12:50:07
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放培養(yǎng)箱和水浴鍋沒(méi)有什么影響，只要保證在這個(gè)溫度下酶的效率是最大發(fā)揮的就沒(méi)有什么問(wèn)題，有時(shí)候室內(nèi)溫度高，可以達(dá)到30幾度，照樣室溫進(jìn)行酶切； 另外buffer 2x tango,就是1/5的比例，就是總體積的五分之一，50ul體系的話添加10ul ，一般如果沒(méi)有特殊說(shuō)明的話就是1/10,加5ul； 至于酶，也就是按照原體系量的二倍來(lái)加，因?yàn)閮煞N酶的活性在此條件和buffer下不是很高，很有可能是50%，比如50ul體系，加2ul，現(xiàn)在加4ul，其實(shí)個(gè)人認(rèn)為具體實(shí)驗(yàn)中加2ul就可以了，不需要加那么多酶，浪費(fèi)。。。 |
8樓2011-07-02 20:52:28
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