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[交流] 【求助/交流】關(guān)于酶切連接轉(zhuǎn)化的問題

大家好，我最近在做酶切，連接，轉(zhuǎn)化，載體是PET-30a大概5420bp 進行了雙酶切，切膠純化，目的片段是300bp雙酶切切膠純化，純化后i跑了電泳，亮度跟marker差不多，連接時我是目的片段與載體各1ul，酶1ul，6ul體系，和25ul體系都做過，只是做轉(zhuǎn)化時平板都沒有長菌，最可能的原因就是沒連上吧，還有連接時的目的片段與載體的摩爾比是3-10:1，我不知道這個該怎么算，換算成體積該怎么加，請做過酶切連接并轉(zhuǎn)化的有經(jīng)驗的大俠指教，我將不勝感激。諸位新年快樂，心想事成。

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1樓 2011-01-01 17:15:59

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brightfuture01

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丫頭7976(金幣+2): 2011-01-02 08:56:41

http://www.promega.com/tbs/9pim180/9pim180.pdf

看看這個里面的摩爾數(shù)怎么計算吧。沒必要做25ul那么大的連接體系。

至于體積，那是和你的DNA濃度相關(guān)的。

你確定感受態(tài)、及酶切都不存在問題么？

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2樓2011-01-01 17:30:25

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brightfuture01

木蟲之王 (文壇精英)

還有就是連接酶用的哪家的？

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3樓2011-01-01 17:31:01

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天使托

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丫頭7976(金幣+2): 2011-01-02 08:58:57

什么叫跟marker一般亮？你沒有做過定量嗎？就是把你酶切純化以后的質(zhì)粒和基因定量，然后再確定連接的量，不過連接我們一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果沒有長的話那肯定就是沒有連接上了，不過連接時間可以稍微長一些，雖說會出現(xiàn)假陽性，但是你可以用pcr快速驗證一下滴！祝實驗順利！

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4樓2011-01-01 18:14:29

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天使托

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Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-01 17:30:25:
http://www.promega.com/tbs/9pim180/9pim180.pdf

看看這個里面的摩爾數(shù)怎么計算吧。沒必要做25ul那么大的連接體系。

至于體積，那是和你的DNA濃度相關(guān)的。

你確定感受態(tài)、及酶切都不存在問題 ...

普洛麥格的說明可以參考一下，不過并不總是這樣子的！

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5樓2011-01-01 18:15:51

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srlee

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丫頭7976(金幣+1):謝謝啊 2011-01-02 09:08:20

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Originally posted by 丫頭7976 at 2011-01-01 17:15:59:
大家好，我最近在做酶切，連接，轉(zhuǎn)化，載體是PET-30a大概5420bp 進行了雙酶切，切膠純化，目的片段是300bp雙酶切切膠純化，純化后i跑了電泳，亮度跟marker差不多，連接時我是目的片段與載體各1ul，酶1ul，6ul體系 ...

這又是大載體小片段的連接問題，不是很好連，但能連的上。
把載體濃度放小一點，目的片段濃度大一點，應該沒問題的！

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6樓2011-01-01 19:54:48

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junyanski

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嗯類似這種情況我們也遇到過不過是做的ta克隆最后發(fā)現(xiàn)是氨芐板出了問題換了試劑就長出來了不知道樓主有沒有做過陽性轉(zhuǎn)化對照來看如果也長不出就要懷疑是不是板出了問題

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7樓2011-01-01 20:29:08

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jerry110

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丫頭7976(金幣+1): 2011-01-02 08:56:05

路過，看看評論，學了不少東西，呵呵

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8樓2011-01-01 20:47:23

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Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-01 17:31:01:
還有就是連接酶用的哪家的？

連接酶是寶生物的，我不能確定切沒切開，做了雙酶切后就連接轉(zhuǎn)化了，多謝提點啊

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9樓2011-01-02 08:58:17

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Originally posted by 天使托 at 2011-01-01 18:14:29:
什么叫跟marker一般亮？你沒有做過定量嗎？就是把你酶切純化以后的質(zhì)粒和基因定量，然后再確定連接的量，不過連接我們一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果沒有長的話那肯定就是沒有連接上了，不過連接時間可 ...

就是跑電泳后在紫外燈下看，目的條帶的亮度和marker的亮度差不多，因為量太少，我不能測，只能估計一下，大概每5ul有50ng，
多謝提點啊

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10樓2011-01-02 09:00:48

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charles08

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4樓: Originally posted by 天使托 at 2011-01-01 18:14:29
什么叫跟marker一般亮？你沒有做過定量嗎？就是把你酶切純化以后的質(zhì)粒和基因定量，然后再確定連接的量，不過連接我們一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果沒有長的話那肯定就是沒有連接上了，不過連接時間可以 ...

我做的經(jīng)常有斑，也很均勻，但是質(zhì)粒酶切總是找不到目的基因，這是為何？
如何消除這種假陽性？

我用PCR快速驗證法總是擴不出來，用載體引物都擴不出

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11樓2013-11-06 14:41:56

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