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liuwei78銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】質(zhì)粒雙酶切連接問(wèn)題 已有7人參與
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有一個(gè)關(guān)于質(zhì)粒雙酶切的問(wèn)題一直沒(méi)弄明白。 雙酶切連接轉(zhuǎn)化完以后，一個(gè)菌里面會(huì)不會(huì)有許多不同大小的質(zhì)粒存在。有的是酶切連接正確的，有的是質(zhì)粒自身連接的，還有的是沒(méi)有連接上的。 如果是這樣的話，那么提質(zhì)粒其實(shí)是把這些不同大小的質(zhì)粒都提取出來(lái)了么？ |
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2樓2011-02-28 14:14:44
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3樓2011-02-28 14:15:20
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連接以后肯定會(huì)存在這種情況，但是我們?cè)谶M(jìn)行連接的時(shí)候一般都把抗青霉素的基因作為篩選標(biāo)記，所以就不會(huì)出現(xiàn)沒(méi)有連接上的情況了，至于自身連接的問(wèn)題，可以把酶切后的片段用堿性磷酸酶處理去磷酸化，這樣就不會(huì)出現(xiàn)自身連接的情況了 |
4樓2011-02-28 15:33:41
susizheng
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5樓2011-02-28 21:39:51
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7樓2011-03-01 10:51:07
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其實(shí)，這是一個(gè)很好的問(wèn)題。 連接時(shí)，如樓主所說(shuō)，會(huì)出現(xiàn)各種連接產(chǎn)物：包括載體A:單載體分子的自連產(chǎn)物，B:兩個(gè)載體分子的自連產(chǎn)物，C:目的基因與載體正確連接的產(chǎn)物，D:兩個(gè)目的基因的自連產(chǎn)物等等 轉(zhuǎn)化時(shí)，這些不同的連接產(chǎn)物，完全有可能進(jìn)入同一個(gè)感受態(tài)細(xì)胞。但是這些連接產(chǎn)物中，只有兩種是可以復(fù)制的：那就是A和C 那為什么在通常情況下，沒(méi)有出現(xiàn)一個(gè)單克隆中出現(xiàn)兩種不同的質(zhì)粒呢？ 事實(shí)上，這就涉及到質(zhì)粒的一個(gè)特性：質(zhì)粒的不相容性。一般認(rèn)為，如果兩種質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)相同，那么這兩個(gè)質(zhì)粒不可能共存于同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中（即在分裂時(shí)，一般為隨機(jī)丟失一種質(zhì)粒，最終表現(xiàn)為只有一種質(zhì)粒存在于一個(gè)單克隆中）。質(zhì)粒不相容性的原因有些不同的假說(shuō)，貌似到現(xiàn)在還不是特別清楚。 但是質(zhì)粒的不相容性也就保證了單克隆中只有一種質(zhì)粒，雖然我們不知道為什么。這也是能夠進(jìn)行分子克隆的一個(gè)基本原理。 但現(xiàn)在越來(lái)越多的事實(shí)表明，質(zhì)粒的不相容性并不是那么嚴(yán)格，這個(gè)現(xiàn)象在文庫(kù)構(gòu)建時(shí)表現(xiàn)的比較明顯，在單克隆測(cè)序時(shí)，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)重峰現(xiàn)象，這通常就是因?yàn)閱慰寺》敝称饋?lái)的群體中含有兩種質(zhì)粒（插入序列不同的克�。� |
8樓2012-03-27 21:50:32
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