丫頭7976

銅蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

應(yīng)助: 8 (幼兒園)
金幣: 89.8
帖子: 800
在線: 217.2小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 765213

[交流] 【求助/交流】關(guān)于酶切連接轉(zhuǎn)化的問(wèn)題

大家好，我最近在做酶切，連接，轉(zhuǎn)化，載體是PET-30a大概5420bp 進(jìn)行了雙酶切，切膠純化，目的片段是300bp雙酶切切膠純化，純化后i跑了電泳，亮度跟marker差不多，連接時(shí)我是目的片段與載體各1ul，酶1ul，6ul體系，和25ul體系都做過(guò)，只是做轉(zhuǎn)化時(shí)平板都沒(méi)有長(zhǎng)菌，最可能的原因就是沒(méi)連上吧，還有連接時(shí)的目的片段與載體的摩爾比是3-10:1，我不知道這個(gè)該怎么算，換算成體積該怎么加，請(qǐng)做過(guò)酶切連接并轉(zhuǎn)化的有經(jīng)驗(yàn)的大俠指教，我將不勝感激。諸位新年快樂(lè)，心想事成。

回復(fù)此樓

» 猜你喜歡

不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI” 已經(jīng)有0人回復(fù)
納米粒度分析已經(jīng)有3人回復(fù)
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)? 已經(jīng)有176人回復(fù)
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京已經(jīng)有0人回復(fù)
留學(xué)--博士招生已經(jīng)有16人回復(fù)
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限已經(jīng)有4人回復(fù)
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦已經(jīng)有6人回復(fù)
邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑已經(jīng)有0人回復(fù)
天津商業(yè)大學(xué) 生物與醫(yī)藥課題組招生已經(jīng)有0人回復(fù)

» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:

虛心請(qǐng)教關(guān)于平—粘末端的連接問(wèn)題已經(jīng)有18人回復(fù)
做酶切連接后轉(zhuǎn)化再提質(zhì)粒，質(zhì)粒明顯變小，Why??? 已經(jīng)有24人回復(fù)
PCR ，雙酶切，連接問(wèn)題已經(jīng)有17人回復(fù)
分子克隆連接問(wèn)題！已經(jīng)有12人回復(fù)
求助各位高人，關(guān)于酶切和連接轉(zhuǎn)化的問(wèn)題已經(jīng)有4人回復(fù)
【求助/交流】單酶切酶和DNA的比例，體系大小的問(wèn)題已經(jīng)有14人回復(fù)
【求助/交流】質(zhì)粒雙酶切連接問(wèn)題已經(jīng)有7人回復(fù)
【求助/交流】關(guān)于酶切產(chǎn)物連接的一點(diǎn)問(wèn)題已經(jīng)有13人回復(fù)

» 搶金幣啦！回帖就可以得到:

查看全部散金貼

1樓 2011-01-01 17:15:59

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

brightfuture01

木蟲(chóng)之王 (文壇精英)

MolEPI: 14
應(yīng)助: 24 (小學(xué)生)
貴賓: 1.2
金幣: 113310
帖子: 28948
在線: 3691.4小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 464575

★ ★
dhd997(金幣+2):good，希望你繼續(xù)加油哦，這幾天出臺(tái)下次VIP獎(jiǎng)勵(lì)制度 2011-01-01 21:20:40
丫頭7976(金幣+2): 2011-01-02 08:56:41

http://www.promega.com/tbs/9pim180/9pim180.pdf

看看這個(gè)里面的摩爾數(shù)怎么計(jì)算吧。沒(méi)必要做25ul那么大的連接體系。

至于體積，那是和你的DNA濃度相關(guān)的。

你確定感受態(tài)、及酶切都不存在問(wèn)題么？

贊一下(1人)

回復(fù)此樓

2樓2011-01-01 17:30:25

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

brightfuture01

木蟲(chóng)之王 (文壇精英)

MolEPI: 14
應(yīng)助: 24 (小學(xué)生)
貴賓: 1.2
金幣: 113310
帖子: 28948
在線: 3691.4小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 464575

還有就是連接酶用的哪家的？

贊一下

回復(fù)此樓

3樓2011-01-01 17:31:01

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

天使托

專家顧問(wèn) (職業(yè)作家)

★ ★
dhd997(金幣+2):good，希望你繼續(xù)加油哦，這幾天出臺(tái)下次VIP獎(jiǎng)勵(lì)制度 2011-01-01 21:21:01
丫頭7976(金幣+2): 2011-01-02 08:58:57

什么叫跟marker一般亮？你沒(méi)有做過(guò)定量嗎？就是把你酶切純化以后的質(zhì)粒和基因定量，然后再確定連接的量，不過(guò)連接我們一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果沒(méi)有長(zhǎng)的話那肯定就是沒(méi)有連接上了，不過(guò)連接時(shí)間可以稍微長(zhǎng)一些，雖說(shuō)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，但是你可以用pcr快速驗(yàn)證一下滴！祝實(shí)驗(yàn)順利！

贊一下(1人)

回復(fù)此樓

4樓2011-01-01 18:14:29

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

天使托

專家顧問(wèn) (職業(yè)作家)

引用回帖:

Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-01 17:30:25:
http://www.promega.com/tbs/9pim180/9pim180.pdf

看看這個(gè)里面的摩爾數(shù)怎么計(jì)算吧。沒(méi)必要做25ul那么大的連接體系。

至于體積，那是和你的DNA濃度相關(guān)的。

你確定感受態(tài)、及酶切都不存在問(wèn)題 ...

普洛麥格的說(shuō)明可以參考一下，不過(guò)并不總是這樣子的！

贊一下

回復(fù)此樓

5樓2011-01-01 18:15:51

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

srlee

鐵桿木蟲(chóng) (小有名氣)

MolEPI: 7
應(yīng)助: 11 (小學(xué)生)
金幣: 4462.7
帖子: 222
在線: 511.1小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 802845

丫頭7976(金幣+1):謝謝啊 2011-01-02 09:08:20

引用回帖:

Originally posted by 丫頭7976 at 2011-01-01 17:15:59:
大家好，我最近在做酶切，連接，轉(zhuǎn)化，載體是PET-30a大概5420bp 進(jìn)行了雙酶切，切膠純化，目的片段是300bp雙酶切切膠純化，純化后i跑了電泳，亮度跟marker差不多，連接時(shí)我是目的片段與載體各1ul，酶1ul，6ul體系 ...

這又是大載體小片段的連接問(wèn)題，不是很好連，但能連的上。
把載體濃度放小一點(diǎn)，目的片段濃度大一點(diǎn)，應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題的！

贊一下

回復(fù)此樓

6樓2011-01-01 19:54:48

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

junyanski

新蟲(chóng) (初入文壇)

應(yīng)助: 0 (幼兒園)
金幣: 23.6
帖子: 4
在線: 1.8小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 942080

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5):鼓勵(lì)新蟲(chóng)交流 2011-01-01 21:21:17
丫頭7976(金幣+2): 2011-01-02 08:55:51

嗯類似這種情況我們也遇到過(guò) 不過(guò)是做的ta克隆最后發(fā)現(xiàn)是氨芐板出了問(wèn)題換了試劑就長(zhǎng)出來(lái)了不知道樓主有沒(méi)有做過(guò)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化對(duì)照來(lái)看如果也長(zhǎng)不出就要懷疑是不是板出了問(wèn)題

贊一下(1人)

回復(fù)此樓

7樓2011-01-01 20:29:08

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

jerry110

新蟲(chóng) (小有名氣)

應(yīng)助: 0 (幼兒園)
金幣: 634.5
帖子: 198
在線: 58.1小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 1137866

丫頭7976(金幣+1): 2011-01-02 08:56:05

路過(guò)，看看評(píng)論，學(xué)了不少東西，呵呵

贊一下

回復(fù)此樓

8樓2011-01-01 20:47:23

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

丫頭7976

銅蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

應(yīng)助: 8 (幼兒園)
金幣: 89.8
帖子: 800
在線: 217.2小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 765213

引用回帖:

Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-01 17:31:01:
還有就是連接酶用的哪家的？

連接酶是寶生物的，我不能確定切沒(méi)切開(kāi)，做了雙酶切后就連接轉(zhuǎn)化了，多謝提點(diǎn)啊

贊一下

回復(fù)此樓

9樓2011-01-02 08:58:17

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

丫頭7976

銅蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

應(yīng)助: 8 (幼兒園)
金幣: 89.8
帖子: 800
在線: 217.2小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 765213

引用回帖:

Originally posted by 天使托 at 2011-01-01 18:14:29:
什么叫跟marker一般亮？你沒(méi)有做過(guò)定量嗎？就是把你酶切純化以后的質(zhì)粒和基因定量，然后再確定連接的量，不過(guò)連接我們一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果沒(méi)有長(zhǎng)的話那肯定就是沒(méi)有連接上了，不過(guò)連接時(shí)間可 ...

就是跑電泳后在紫外燈下看，目的條帶的亮度和marker的亮度差不多，因?yàn)榱刻�，我不能測(cè)，只能估計(jì)一下，大概每5ul有50ng，
多謝提點(diǎn)啊

贊一下

回復(fù)此樓

10樓2011-01-02 09:00:48

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

charles08

鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

應(yīng)助: 9 (幼兒園)
金幣: 5788.3
帖子: 1928
在線: 603小時(shí)
蟲(chóng)號(hào): 823046

引用回帖:

4樓: Originally posted by 天使托 at 2011-01-01 18:14:29
什么叫跟marker一般亮？你沒(méi)有做過(guò)定量嗎？就是把你酶切純化以后的質(zhì)粒和基因定量，然后再確定連接的量，不過(guò)連接我們一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果沒(méi)有長(zhǎng)的話那肯定就是沒(méi)有連接上了，不過(guò)連接時(shí)間可以 ...

我做的經(jīng)常有斑，也很均勻，但是質(zhì)粒酶切總是找不到目的基因，這是為何？
如何消除這種假陽(yáng)性？

我用PCR快速驗(yàn)證法總是擴(kuò)不出來(lái)，用載體引物都擴(kuò)不出

贊一下

回復(fù)此樓

11樓2013-11-06 14:41:56

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

最具人氣熱帖推薦 [查看全部]	作者	回/看	最后發(fā)表

[考研] 316求調(diào)劑 +11	舟自梗 2026-04-01	12/600	2026-04-02 10:12 by 不吃魚(yú)的貓
[考研] 0710生物學(xué)，325求調(diào)劑 +3	mkkkkkl 2026-04-01	3/150	2026-04-02 09:48 by Jaylen.
[考研] 考研調(diào)劑 +12	Amber00 2026-03-31	12/600	2026-04-02 09:04 by sanrepian
[考博] 26年申博 +3	staryer 2026-03-30	4/200	2026-04-01 23:21 by ai4pharm
[考研] 安全工程 285 求調(diào)劑 +3	Xinyu56 2026-04-01	4/200	2026-04-01 21:50 by 靜靜靜靜靜靜靜?/a>
[考研] 材料調(diào)劑 +14	一樣YWY 2026-04-01	14/700	2026-04-01 21:07 by lijunpoly
[考研] 求調(diào)劑 +4	圖鑒212 2026-03-30	5/250	2026-04-01 15:32 by 圖鑒212
[考研] 086000生物與醫(yī)藥298調(diào)劑求助 +4	元元青青 2026-03-31	6/300	2026-04-01 11:13 by syh9288
[考研] 0856材料化工調(diào)劑總分330 +18	zhubinhao 2026-03-27	18/900	2026-04-01 09:37 by oooqiao
[考研] 070300化學(xué)專業(yè)279調(diào)劑 +10	哈哈哈^_^ 2026-03-31	10/500	2026-03-31 23:13 by liu823948201
[考研] 抱歉 +4	田洪有 2026-03-30	4/200	2026-03-30 21:26 by mumin1990
[考研] 一志愿華中師范化學(xué)332分求調(diào)劑 +3	Lyy930824@ 2026-03-29	3/150	2026-03-30 20:15 by DHUSHUAI
[考研] 304材料求調(diào)劑 +5	鐘llll 2026-03-26	5/250	2026-03-30 19:37 by 源_2020
[有機(jī)交流] 考研調(diào)劑 +8	watb 2026-03-26	8/400	2026-03-30 18:40 by 544594351
[考研] 環(huán)境科學(xué)與工程334分求調(diào)劑 +6	王一一依依 2026-03-30	8/400	2026-03-30 11:52 by yjolah
[考研] 求調(diào)劑，一志愿南京航空航天大學(xué)大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩 +6	@taotao 2026-03-26	7/350	2026-03-30 10:43 by 我是小康
[考研] 085405 考的11408求各位老師帶走 +3	Qiu學(xué)ing 2026-03-28	3/150	2026-03-28 09:19 by 樂(lè)呵呵的追夢(mèng)人
[考研] 0856調(diào)劑 +5	求求讓我有書(shū)讀?/a> 2026-03-26	6/300	2026-03-27 15:12 by caszguilin
[考研] 08開(kāi)頭275求調(diào)劑 +4	拉誰(shuí)不重要 2026-03-26	4/200	2026-03-27 14:12 by Delta2012
[考研] 一志愿吉大071010，316分求調(diào)劑 +3	xgbiknn 2026-03-27	3/150	2026-03-27 10:36 by guoweigw