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蛀蟲英新蟲 (初入文壇)
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[求助]
雙酶切問題，跪求指導(dǎo)啊
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各位大牛，誰來幫幫我啊，我最近做雙酶切，目的片段500左右，連載pmd18-simple-t載體上，用的是NEB公司的not1和bamh1兩個(gè)酶進(jìn)行酶切，測序序列正確，可是not1就是切不動(dòng)，not1我已經(jīng)驗(yàn)證過了好用，什么單切，過夜切,都試過了，我用的是20ul體系酶各加0.5,單切10ul,20ul都用過了，。。。神了啊 ，這種情況我改怎么辦啊 |
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你說得不是很清楚。我的理解是： 你已經(jīng)將500bp的片段克隆至載體pmd-simple-t了，現(xiàn)在準(zhǔn)備用NotI+BamHI將此500bp片段切下來（可能準(zhǔn)備亞克�。浚�，問題出在雙酶切上，對吧？ 如果上述推測正確，那么我建議你先對你的質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量，然后各取1ugDNA,分別用NotI或BamHI進(jìn)行單酶切，看看此兩個(gè)酶切位點(diǎn)是否都能成功進(jìn)行單切。（質(zhì)粒成功進(jìn)行單酶切后電泳的帶型與未酶切的質(zhì)粒不一樣，電泳可以明顯分辨）。 然后再考慮雙酶切。 酶切時(shí)的兩種酶的具體用量，我建議你利用double digestion designer(http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php)進(jìn)行計(jì)算，不要隨意估計(jì)，以確保完全酶切或者不會(huì)因酶量過多而出現(xiàn)酶的星活性。 |
2樓2013-10-08 16:55:27
sxxuan
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| 你的描述不太清楚，你說Not1好用，指的是你用這個(gè)酶單切切的是你這個(gè)片段，還是只是為了驗(yàn)證這個(gè)酶是否好用而切得其他帶有Not1酶切位點(diǎn)的片段。如果你切的是你自己的片段，那么單酶切能切開，雙酶切切不開，那么你要考慮你用的buffer和反應(yīng)條件是否不適合Not1，但是如果你的意思是你只是單純的驗(yàn)證了你的Not1好用，而用這個(gè)酶切不開你的片段，那么建議你只用Not1單酶切，如果切不開那么是引物合成的公司可能給你合成錯(cuò)了酶切位點(diǎn)。我遇到過這種情況 |
4樓2013-10-08 17:17:41
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6樓2013-10-08 17:22:21
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