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[交流] 雙酶切時(shí)間怎么確定

我自己在Prok2的基礎(chǔ)上構(gòu)建的載體，用Xbal 1和BamH1雙酶切，20ul的體系，要切多長(zhǎng)時(shí)間比較合適呢，2個(gè)小時(shí)，還是三個(gè)小時(shí)？有做過(guò)的嗎？指點(diǎn)一下

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1樓 2011-06-13 15:58:02

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空谷幽風(fēng)

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蘇拉的世界(金幣+1):謝謝參與
lstt09nk(金幣+2): 感謝參與 2011-06-14 07:43:44

這兩個(gè)酶的最適溫度都是37℃，一般酶切2h足夠了，如果兩個(gè)酶最適酶切溫度不一樣的話一定要分開(kāi)酶切

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2樓2011-06-13 16:12:24

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蘇拉的世界

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Originally posted by 空谷幽風(fēng) at 2011-06-13 16:12:24:
這兩個(gè)酶的最適溫度都是37℃，一般酶切2h足夠了，如果兩個(gè)酶最適酶切溫度不一樣的話一定要分開(kāi)酶切

倆酶一個(gè)是37度的，一個(gè)是30度的，用30度進(jìn)行酶切的

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3樓2011-06-13 17:34:06

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lxj341401

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蘇拉的世界(金幣+1):謝謝參與
lstt09nk(金幣+1): 是的，跟酶量也有關(guān)系啊 2011-06-14 07:45:31

跟底物也就是DNA的量還有關(guān)系的。

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4樓2011-06-13 20:26:11

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xuexue1204

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蘇拉的世界(金幣+1):謝謝參與
lstt09nk(金幣+2): 歡迎交流 2011-06-14 07:46:36

兩個(gè)酶可以分開(kāi)切的，你可以先同時(shí)切，切完跑膠看看，如果切不開(kāi)的話，就分開(kāi)切試試，一般不會(huì)有太大問(wèn)題的

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5樓2011-06-13 20:46:24

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wutongyu77

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蘇拉的世界(金幣+1):謝謝參與

我覺(jué)得：加入的順序很關(guān)鍵，先加水，再加buffer,然后質(zhì)粒模板，最后加內(nèi)切酶，酶切3小時(shí)，模板加的稍微多點(diǎn)，回收時(shí)每個(gè)點(diǎn)樣孔加50微升，效果就很好了。

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6樓2011-06-15 10:58:23

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feng__

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7樓2011-06-15 11:11:54

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jia1012428

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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖

加試劑先后順序沒(méi)關(guān)系，只要混勻就行了，如果2個(gè)酶在通用緩沖液里的酶切效率都是100%，那2h就夠了，不放心可以延長(zhǎng)時(shí)間，不要超過(guò)4h。

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8樓2011-06-15 19:53:26

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great4591

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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖

酶切不用那么長(zhǎng)時(shí)間，應(yīng)該根據(jù)酶單位的定義來(lái)就行，一般37度一個(gè)小時(shí)就行，關(guān)鍵是訂好模板量

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9樓2011-06-15 23:04:46

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qdwmq

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與試劑的添加順序無(wú)關(guān)，一般3h足夠，NEB的Timesaver的話5min。

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10樓2011-06-15 23:23:11

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