 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 3226 | 回復(fù): 14 | ||
zhoubin0823木蟲 (小有名氣)
|
[求助]
糾結(jié)的分子實驗，雙酶切連不上，求助
|
|
我用的表達載體是pMAL-c5X,選的酶切位點是NdeⅠ與NotⅠ，T載體用的是pMD19-T，目的基因片段2200左右，T載體與目的基因連上了，測序正確，分別將表達載體與連上目的基因的T載體雙酶切后，分別按載體：目的基因為1:7、2:6的比例連接，就是沒有長菌，怎么回事？求高手解答。期間做過一些對照試驗： 1：用未酶切的質(zhì)粒pMAL-c5X轉(zhuǎn)化感受態(tài)可以得到大量單菌落，以此排除感受態(tài)問題。 2：分別用連接酶連接雙酶切的pMAL-c5x與連接目的基因的T載體，結(jié)果顯示不長單菌落，以此排除酶切不充分。 3：實驗室的連接酶其他同學(xué)成功連接過，也可以排除連接酶的問題。 那么是因為目的基因片段太大，難以連接嗎？求解答�。�！ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有123人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦
已經(jīng)有3人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 測序正確的片段雙酶切連接表達載體，提質(zhì)粒PCR驗證后，還需要再次測序嗎？
已經(jīng)有11人回復(fù)
- （基因克�。╇p酶切結(jié)果與目的條帶大小不一致，求有經(jīng)驗的人幫幫我。
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 雙酶切怎么操作才能完全徹底呢！
已經(jīng)有27人回復(fù)
- reverse PCR 線性化載體
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 雙酶切的目的基因與質(zhì)粒連接不上怎么辦
已經(jīng)有25人回復(fù)
- 酶切連接連不上，要死了
已經(jīng)有23人回復(fù)
- PBⅠ121質(zhì)粒雙酶切問題
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 空質(zhì)粒雙酶切出現(xiàn)非常相近的兩條帶？轉(zhuǎn)化長滿板？
已經(jīng)有23人回復(fù)
- 反應(yīng)很簡單，但是后處理就有點讓人糾結(jié)了，做過的給支支招
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 求助，酶切之后，非但是沒有產(chǎn)物，而且連原本的質(zhì)粒也沒跑出來
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 雙酶切后如何才能讓載體自連？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- pMD19-T雙酶切，目的片段上酶切位點和載體上一樣
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 雙酶切轉(zhuǎn)化之后不長菌
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 什么方法確定插入目的片段后表達載體的閱讀框有無發(fā)生變化？
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 雙酶切問題，跪求指導(dǎo)啊
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 如何做分步雙酶切
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 將目的基因連入表達質(zhì)粒，酶切位點問題
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 雙酶切后是否還要膠回收
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 雙酶切連接轉(zhuǎn)化后貌似出現(xiàn)自連
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 求助--雙酶切連接構(gòu)質(zhì)粒
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 單酶切連接轉(zhuǎn)化，感受態(tài)的問題？！
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于雙酶切
已經(jīng)有6人回復(fù)
zhoulubin
銀蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 26 (小學(xué)生)
- 金幣: 687.8
- 帖子: 122
- 在線: 70.9小時
- 蟲號: 1215331
- 注冊: 2011-02-27
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物遺傳學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhoubin0823(myprayer代發(fā)): 金幣+1, Send one rose fragrance in hand, thank you loosen one's purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-06-09 08:48:36
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhoubin0823(myprayer代發(fā)): 金幣+1, Send one rose fragrance in hand, thank you loosen one's purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-06-09 08:48:36
|
一、2.2kb的片段應(yīng)該不大，不知道pMAL-c5X載體多大，這個載體好像不是很常見吶。 二、”分別將表達載體與連上目的基因的T載體雙酶切后，分別按載體：目的基因為1:7、2:6的比例連接，就是沒有長菌“，沒有載體圖，也不知道切下來的片段多大，我想你應(yīng)該知道根據(jù)不同大小去進行膠回收純化或PCR產(chǎn)物純化吧。 三、連接的比例1:2~1:5是指摩爾比，要考慮片段大小的，這個建議參考TaKaRa pMD18、19T Vector 說明書中算法。一般做得多的話，都是直接根據(jù)電泳條帶亮度做相應(yīng)調(diào)整。如果樣品濃度低，可以不加水，增大反應(yīng)體系。 四、一般片段較長，連接時間相應(yīng)也較長，不同公司的ligase給的參考條件不一樣，建議16℃過夜。 五、酶切時間按照說明書來，不是時間越長越好，有些酶長時間incubator會有星活性。 最后，突然發(fā)現(xiàn)我們用戶名挺像 |
2樓2013-06-08 21:53:57
zhoubin0823
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 3771.7
- 散金: 30
- 紅花: 2
- 帖子: 223
- 在線: 230.1小時
- 蟲號: 1421944
- 注冊: 2011-09-29
- 性別: MM
- 專業(yè): 蛋白質(zhì)組學(xué)
3樓2013-06-11 10:47:51
4樓2013-06-11 19:27:02
5樓2013-06-11 21:52:30
yuxia82012
木蟲 (著名寫手)
- MolEPI: 3
- 應(yīng)助: 20 (小學(xué)生)
- 金幣: 4980
- 散金: 2225
- 紅花: 2
- 帖子: 1340
- 在線: 426.5小時
- 蟲號: 781881
- 注冊: 2009-05-29
- 性別: GG
- 專業(yè): 有機合成
【答案】應(yīng)助回帖
★
zhoubin0823(myprayer代發(fā)): 金幣+1, Send one rose fragrance in hand, thank you loosen one's purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-06-14 08:15:18
zhoubin0823(myprayer代發(fā)): 金幣+1, Send one rose fragrance in hand, thank you loosen one's purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-06-14 08:15:18
|
你先把回收的片段跑膠看看確定濃度以及有沒有會受到，如果都沒問題的話，我不知道你連接體系用的多大，我一般是10uL的連接體系，除了酶和buffer外其余全加連接片段，一般載體加1 uL，其余就是插入基因了。 實在不行，你問問你們實驗室有沒有人用這個載體構(gòu)建出來過質(zhì)粒，有的話問他要一點切一下做載體，這個能確保切得完全。 |
6樓2013-06-11 23:15:59
zhoubin0823
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 3771.7
- 散金: 30
- 紅花: 2
- 帖子: 223
- 在線: 230.1小時
- 蟲號: 1421944
- 注冊: 2011-09-29
- 性別: MM
- 專業(yè): 蛋白質(zhì)組學(xué)
7樓2013-06-13 10:10:13
zhoubin0823
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 3771.7
- 散金: 30
- 紅花: 2
- 帖子: 223
- 在線: 230.1小時
- 蟲號: 1421944
- 注冊: 2011-09-29
- 性別: MM
- 專業(yè): 蛋白質(zhì)組學(xué)
8樓2013-06-13 10:13:43
zhoubin0823
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 3771.7
- 散金: 30
- 紅花: 2
- 帖子: 223
- 在線: 230.1小時
- 蟲號: 1421944
- 注冊: 2011-09-29
- 性別: MM
- 專業(yè): 蛋白質(zhì)組學(xué)
9樓2013-06-13 10:20:13
10樓2013-06-13 14:28:37
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 zhoubin0823 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +12 | Y-cap 2026-03-29 | 15/750 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 調(diào)劑申請 +3 | 張張張張zy 2026-03-31 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 370求調(diào)劑 +3 | 080700調(diào)劑 2026-03-30 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 288資源與環(huán)境專碩求調(diào)劑，不限專業(yè)，有學(xué)上就行 +11 | lllllos 2026-03-30 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 材料科學(xué)與工程 317求調(diào)劑 +7 | JKSOIID 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 359求調(diào)劑 +5 | 王了個楠 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 317分 一志愿南理工材料工程 本科湖工大 求調(diào)劑 +12 | 芋泥小鈴鐺 2026-03-28 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑，一志愿西北工業(yè)大學(xué)，材料工程（085601） +5 | 小小機靈蟲 2026-03-29 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 324求調(diào)劑 +9 | hanamiko 2026-03-26 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 284求調(diào)劑 +14 | junqihahaha 2026-03-26 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京工業(yè)大學(xué)，324分求調(diào)劑 +6 | 零八# 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿雙一流機械285分求調(diào)劑 +4 | 幸運的三木 2026-03-29 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 數(shù)一英一271專碩（085401）求調(diào)劑，可跨 +7 | 前行必有光 2026-03-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 11408軟件工程求調(diào)劑 +3 | Qiu學(xué)ing 2026-03-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 本科新能源科學(xué)與工程，一志愿華理能動285求調(diào)劑 +7 | AZMK 2026-03-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑一志愿哈工大324 +7 | 閆旭東 2026-03-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 086502化學(xué)工程342求調(diào)劑 +6 | 阿姨復(fù)古不過 2026-03-27 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 266分求材料化工冶金礦業(yè)等專業(yè)的調(diào)劑 +4 | 哇呼哼呼哼 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +6 | 林之夕 2026-03-24 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿 南京郵電大學(xué) 288分 材料考研 求調(diào)劑 +3 | jl0720 2026-03-26 | 3/150 |
|