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zhoubin0823木蟲 (小有名氣)
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[求助]
糾結(jié)的分子實(shí)驗(yàn)，雙酶切連不上，求助
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我用的表達(dá)載體是pMAL-c5X,選的酶切位點(diǎn)是NdeⅠ與NotⅠ，T載體用的是pMD19-T，目的基因片段2200左右，T載體與目的基因連上了，測(cè)序正確，分別將表達(dá)載體與連上目的基因的T載體雙酶切后，分別按載體：目的基因?yàn)?:7、2:6的比例連接，就是沒有長(zhǎng)菌，怎么回事？求高手解答。期間做過一些對(duì)照試驗(yàn)： 1：用未酶切的質(zhì)粒pMAL-c5X轉(zhuǎn)化感受態(tài)可以得到大量單菌落，以此排除感受態(tài)問題。 2：分別用連接酶連接雙酶切的pMAL-c5x與連接目的基因的T載體，結(jié)果顯示不長(zhǎng)單菌落，以此排除酶切不充分。 3：實(shí)驗(yàn)室的連接酶其他同學(xué)成功連接過，也可以排除連接酶的問題。 那么是因?yàn)槟康幕蚱翁螅y以連接嗎？求解答�。�！ |
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zhoubin0823
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7樓2013-06-13 10:10:13
zhoulubin
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【答案】應(yīng)助回帖
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一、2.2kb的片段應(yīng)該不大，不知道pMAL-c5X載體多大，這個(gè)載體好像不是很常見吶。 二、”分別將表達(dá)載體與連上目的基因的T載體雙酶切后，分別按載體：目的基因?yàn)?:7、2:6的比例連接，就是沒有長(zhǎng)菌“，沒有載體圖，也不知道切下來的片段多大，我想你應(yīng)該知道根據(jù)不同大小去進(jìn)行膠回收純化或PCR產(chǎn)物純化吧。 三、連接的比例1:2~1:5是指摩爾比，要考慮片段大小的，這個(gè)建議參考TaKaRa pMD18、19T Vector 說明書中算法。一般做得多的話，都是直接根據(jù)電泳條帶亮度做相應(yīng)調(diào)整。如果樣品濃度低，可以不加水，增大反應(yīng)體系。 四、一般片段較長(zhǎng)，連接時(shí)間相應(yīng)也較長(zhǎng)，不同公司的ligase給的參考條件不一樣，建議16℃過夜。 五、酶切時(shí)間按照說明書來，不是時(shí)間越長(zhǎng)越好，有些酶長(zhǎng)時(shí)間incubator會(huì)有星活性。 最后，突然發(fā)現(xiàn)我們用戶名挺像 |
2樓2013-06-08 21:53:57
zhoubin0823
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3樓2013-06-11 10:47:51
4樓2013-06-11 19:27:02
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