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qfbushizi2008銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
雙酶切連接轉(zhuǎn)化后貌似出現(xiàn)自連
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我想克隆一個(gè)基因到表達(dá)載體PGEX-6P-2，該質(zhì)粒大小5000，我的目的基因3000左右，連接前酶切產(chǎn)物檢測(cè)了，大小正確，練接轉(zhuǎn)化后，挑克隆，提取質(zhì)粒，并單酶切檢測(cè)大小，竟然是5000左右，感覺(jué)像自連，但雙酶切應(yīng)該不會(huì)發(fā)生自連，我用的兩個(gè)酶是EcoI 和Not I，PCR擴(kuò)增也沒(méi)出來(lái)，如果沒(méi)連上，應(yīng)該菌不會(huì)找。求分析愿意，哪的問(wèn)題，想了半天找不出來(lái)，謝謝！見(jiàn)圖；第二個(gè)圖，第一個(gè)帶，是質(zhì)粒雙酶切，2為，目的基因雙酶切，3轉(zhuǎn)化后，挑克隆，提取質(zhì)粒單酶切，4是22000的Marker 123.JPG 456.JPG |
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cicelyzh
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
qfbushizi2008: 金幣+10, ★★★很有幫助 2013-06-13 13:26:01
myprayer: 金幣+1, Send one rose fragrance in hand, thank you loosen one's purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-06-13 13:40:00
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| 載體自連說(shuō)明雙酶切載體時(shí)酶切不完全，雖然切成線(xiàn)性分子，但是載體雙酶切的帶和單酶切的帶幾乎一樣大，很難分辨的。你的情況很可能是其中的一個(gè)酶切得不好。你做雙酶切載體的同時(shí)最好分別做兩個(gè)酶的單酶切對(duì)照，酶的用量要根據(jù)酶活性和質(zhì)粒的用量來(lái)加。 |
2樓2013-06-13 12:53:18
gzl9901
鐵桿木蟲(chóng) (文壇精英)
very good
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3樓2013-06-13 13:42:54
qfbushizi2008
銅蟲(chóng) (小有名氣)
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4樓2013-06-13 16:08:15
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