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qfbushizi2008銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
雙酶切連接轉(zhuǎn)化后貌似出現(xiàn)自連
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我想克隆一個基因到表達載體PGEX-6P-2，該質(zhì)粒大小5000，我的目的基因3000左右，連接前酶切產(chǎn)物檢測了，大小正確，練接轉(zhuǎn)化后，挑克隆，提取質(zhì)粒，并單酶切檢測大小，竟然是5000左右，感覺像自連，但雙酶切應該不會發(fā)生自連，我用的兩個酶是EcoI 和Not I，PCR擴增也沒出來，如果沒連上，應該菌不會找。求分析愿意，哪的問題，想了半天找不出來，謝謝！見圖；第二個圖，第一個帶，是質(zhì)粒雙酶切，2為，目的基因雙酶切，3轉(zhuǎn)化后，挑克隆，提取質(zhì)粒單酶切，4是22000的Marker 123.JPG 456.JPG |
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qfbushizi2008
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4樓2013-06-13 16:08:15
cicelyzh
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| 載體自連說明雙酶切載體時酶切不完全，雖然切成線性分子，但是載體雙酶切的帶和單酶切的帶幾乎一樣大，很難分辨的。你的情況很可能是其中的一個酶切得不好。你做雙酶切載體的同時最好分別做兩個酶的單酶切對照，酶的用量要根據(jù)酶活性和質(zhì)粒的用量來加。 |
2樓2013-06-13 12:53:18
gzl9901
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3樓2013-06-13 13:42:54
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