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billtsu木蟲 (正式寫手)
木木
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[求助]
目的片段與載體連接后無(wú)法檢測(cè)出
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要做 互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，需要的目的片段（2.8kb）用PCR擴(kuò)增，雙酶切后T4連接酶連到載體pCT-Zori 上，轉(zhuǎn)入DH5α中，用Cm+Xgal+IPTG 的平板做藍(lán)白斑篩選，基本上的到的全部是白斑，選取白斑擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，但是沒有目的片段的出現(xiàn)，雙酶切也沒有目的片段（條帶只有一條，載體的）。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)了好久了，結(jié)果都是這樣的 求各位大牛幫忙分析下，謝謝啦！ |
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2樓2012-08-10 18:07:25
billtsu
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3樓2012-08-10 18:25:34
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)積極熱心應(yīng)助 2012-08-13 14:58:27
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)積極熱心應(yīng)助 2012-08-13 14:58:27
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樓主，最后提取到質(zhì)粒沒有？ 我的意思是你提取質(zhì)粒后跑膠了沒有，可以取1微升跑個(gè)膠看下。 如果質(zhì)粒是提出來(lái)了的，可以用單、雙酶切同時(shí)鑒定. 單酶切可以知道酶切后分子量的大小（假設(shè)為8000bp）,假設(shè)你的質(zhì)粒是6000bp，那么你的連接可能是成功的。 雙酶切，可以更準(zhǔn)確的知道你的連接片段的長(zhǎng)度，但是有時(shí)候雙酶切兩個(gè)酶的酶切溫度并不一致會(huì)造成酶切不充分或者其中之一的酶沒工作。 個(gè)人覺得用單雙酶切進(jìn)行相互印證是比較可靠的。 此外，樓主在轉(zhuǎn)化的時(shí)候可以做2個(gè)對(duì)照，1.原來(lái)做過(guò)的成功的做一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，2，陰性對(duì)照，可以用空載體。 最后，你的片段是否太大沒有連上，或者連接時(shí)間或溫度等不適合？此外，請(qǐng)?jiān)偬羧慰寺『笞鼍銹CR來(lái)驗(yàn)證是否克隆時(shí)正確的，同時(shí)用你的引物（連接片段中可設(shè)計(jì)特異引物）以及載體的通用引物（或者你自己根據(jù)載體設(shè)計(jì)也可以），同一個(gè)單菌落挑取后混勻到10微升水里，分別取1微升出來(lái)，用上述2對(duì)引物擴(kuò)增來(lái)確定克隆正確與否。 |
4樓2012-08-10 21:49:52
billtsu
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5樓2012-08-12 09:52:46
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6樓2012-08-12 19:46:38
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流經(jīng)驗(yàn) 2012-08-13 14:58:40
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流經(jīng)驗(yàn) 2012-08-13 14:58:40
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做的比較相似，遇到的問(wèn)題更麻煩，菌落PCR結(jié)果都OK的，測(cè)序還是空載的，煩人。 但是學(xué)了個(gè)方法，可以先看看是否連接上了：在連接后，轉(zhuǎn)化前，把你的連接產(chǎn)物做為模版，用載體的通用引物做PCR，如果有目標(biāo)條帶，那么應(yīng)該是連接OK了，再做轉(zhuǎn)化的驗(yàn)證；如果沒有，可能連接這一步還要優(yōu)化下。 不知道對(duì)樓主有沒有啟示  |
7樓2012-08-12 21:22:58
chenguestc
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