 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 8 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2141 | 回復(fù): 7 | ||
billtsu木蟲 (正式寫手)
木木
|
[求助]
目的片段與載體連接后無法檢測出
|
|
要做 互補實驗，需要的目的片段（2.8kb）用PCR擴增，雙酶切后T4連接酶連到載體pCT-Zori 上，轉(zhuǎn)入DH5α中，用Cm+Xgal+IPTG 的平板做藍(lán)白斑篩選，基本上的到的全部是白斑，選取白斑擴大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，進行PCR驗證，但是沒有目的片段的出現(xiàn)，雙酶切也沒有目的片段（條帶只有一條，載體的）。 實驗重復(fù)了好久了，結(jié)果都是這樣的 求各位大牛幫忙分析下，謝謝啦！ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有233人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 質(zhì)粒和目的片段
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 目的片段和載體連接一直不上
已經(jīng)有24人回復(fù)
- 如何檢測目的片段轉(zhuǎn)沒轉(zhuǎn)到質(zhì)粒上？
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 緊！急！如何確定目的片段的長度
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 可容納大片段的載體
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 載體與片段連不上
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 如何獲取目的質(zhì)粒？
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 挑取單克隆后的PCR驗證
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 目的基因與載體連接問題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 表達(dá)載體和目的片段鏈接問題
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 質(zhì)粒提取后的檢測方法
已經(jīng)有8人回復(fù)
- pMD18-T載體連接了目的片段后雙酶切鑒定出現(xiàn)了好多條帶 怎么回事?
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 載體為什么連不上呢
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 雙酶切連接轉(zhuǎn)化后貌似出現(xiàn)自連
已經(jīng)有3人回復(fù)
- DNA片段連接到載體上都有什么方法
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 目的片段和T載體連接后PCR條帶詭異
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 2.7Kb的片段連接問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 空質(zhì)粒雙酶切后出現(xiàn)消失的情況
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 質(zhì)粒與片段的連接
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 未插入目的片段的空載體質(zhì)粒怎么擴增出目的條帶，求解，求真相�。。�！
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 關(guān)于連接轉(zhuǎn)化載體和片段的問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 目的片段與表達(dá)載體的連接
已經(jīng)有23人回復(fù)
- T載體連接目的片段后做藍(lán)白斑全都是假陽性
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 長片段DNA如何連接載體
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 【求助/交流】怎么就是p不出目的片段啊
已經(jīng)有16人回復(fù)
2樓2012-08-10 18:07:25
billtsu
木蟲 (正式寫手)
木木
- 應(yīng)助: 6 (幼兒園)
- 金幣: 2569.2
- 紅花: 3
- 帖子: 438
- 在線: 431.2小時
- 蟲號: 1311030
- 注冊: 2011-05-31
- 專業(yè): 環(huán)境微生物學(xué)
3樓2012-08-10 18:25:34
chenguestc
木蟲 (職業(yè)作家)
- MolEPI: 7
- 應(yīng)助: 576 (博士)
- 貴賓: 0.4
- 金幣: 4526.9
- 散金: 1639
- 紅花: 176
- 帖子: 4708
- 在線: 353.5小時
- 蟲號: 1337860
- 注冊: 2011-07-05
- 性別: GG
- 專業(yè): 作物分子育種
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵積極熱心應(yīng)助 2012-08-13 14:58:27
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵積極熱心應(yīng)助 2012-08-13 14:58:27
|
樓主，最后提取到質(zhì)粒沒有？ 我的意思是你提取質(zhì)粒后跑膠了沒有，可以取1微升跑個膠看下。 如果質(zhì)粒是提出來了的，可以用單、雙酶切同時鑒定. 單酶切可以知道酶切后分子量的大小（假設(shè)為8000bp）,假設(shè)你的質(zhì)粒是6000bp，那么你的連接可能是成功的。 雙酶切，可以更準(zhǔn)確的知道你的連接片段的長度，但是有時候雙酶切兩個酶的酶切溫度并不一致會造成酶切不充分或者其中之一的酶沒工作。 個人覺得用單雙酶切進行相互印證是比較可靠的。 此外，樓主在轉(zhuǎn)化的時候可以做2個對照，1.原來做過的成功的做一個陽性對照，2，陰性對照，可以用空載體。 最后，你的片段是否太大沒有連上，或者連接時間或溫度等不適合？此外，請再挑取單克隆后做菌落PCR來驗證是否克隆時正確的，同時用你的引物（連接片段中可設(shè)計特異引物）以及載體的通用引物（或者你自己根據(jù)載體設(shè)計也可以），同一個單菌落挑取后混勻到10微升水里，分別取1微升出來，用上述2對引物擴增來確定克隆正確與否。 |
4樓2012-08-10 21:49:52
billtsu
木蟲 (正式寫手)
木木
- 應(yīng)助: 6 (幼兒園)
- 金幣: 2569.2
- 紅花: 3
- 帖子: 438
- 在線: 431.2小時
- 蟲號: 1311030
- 注冊: 2011-05-31
- 專業(yè): 環(huán)境微生物學(xué)
5樓2012-08-12 09:52:46
chenguestc
木蟲 (職業(yè)作家)
- MolEPI: 7
- 應(yīng)助: 576 (博士)
- 貴賓: 0.4
- 金幣: 4526.9
- 散金: 1639
- 紅花: 176
- 帖子: 4708
- 在線: 353.5小時
- 蟲號: 1337860
- 注冊: 2011-07-05
- 性別: GG
- 專業(yè): 作物分子育種
6樓2012-08-12 19:46:38
scutphoenix
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 2294.6
- 散金: 150
- 紅花: 1
- 帖子: 520
- 在線: 53.8小時
- 蟲號: 348663
- 注冊: 2007-04-18
- 專業(yè): 病毒學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流經(jīng)驗 2012-08-13 14:58:40
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流經(jīng)驗 2012-08-13 14:58:40
|
做的比較相似，遇到的問題更麻煩，菌落PCR結(jié)果都OK的，測序還是空載的，煩人。 但是學(xué)了個方法，可以先看看是否連接上了：在連接后，轉(zhuǎn)化前，把你的連接產(chǎn)物做為模版，用載體的通用引物做PCR，如果有目標(biāo)條帶，那么應(yīng)該是連接OK了，再做轉(zhuǎn)化的驗證；如果沒有，可能連接這一步還要優(yōu)化下。 不知道對樓主有沒有啟示  |
7樓2012-08-12 21:22:58
chenguestc
木蟲 (職業(yè)作家)
- MolEPI: 7
- 應(yīng)助: 576 (博士)
- 貴賓: 0.4
- 金幣: 4526.9
- 散金: 1639
- 紅花: 176
- 帖子: 4708
- 在線: 353.5小時
- 蟲號: 1337860
- 注冊: 2011-07-05
- 性別: GG
- 專業(yè): 作物分子育種
8樓2012-08-13 08:11:40
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 billtsu 的主題更新
| 8 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿武理材料305分求調(diào)劑 +3 | 想上岸的鯉魚 2026-03-18 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 085601材料工程專碩求調(diào)劑 +6 | 慕寒mio 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +3 | 冷笙123 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 考研化學(xué)學(xué)碩調(diào)劑，一志愿985 +4 | 張vvvv 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +6 | Zz版 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工求調(diào)劑 +5 | 緒幸與子 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料與化工專碩調(diào)劑 +5 | heming3743 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 +4 | 安全上岸！ 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +10 | 小樓。 2026-03-12 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 070303一志愿西北大學(xué)學(xué)碩310找調(diào)劑 +5 | d如愿上岸 2026-03-12 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 290分有科研經(jīng)歷，論文在投 +7 | 膩膩gk 2026-03-14 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 326求調(diào)劑 +3 | mlpqaz03 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 294求調(diào)劑 +3 | Zys010410@ 2026-03-13 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料與化工 323 英一+數(shù)二+物化，一志愿：哈工大 本人本科雙一流 +4 | 自由的_飛翔 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +4 | 威化餅07 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[基金申請]
有必要更換申報口嗎
 20+3
|
fannyamoy 2026-03-11 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 招收0805（材料）調(diào)劑 +3 | 18595523086 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0856材料與化工301求調(diào)劑 +5 | 奕束光 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑，材料、化工皆可 +8 | 蘇打水7777 2026-03-11 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 152697 2026-03-12 | 4/200 |
|