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[求助]
目的片段和載體連接一直不上 已有7人參與
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1、目的片段738bp（兩端帶酶切位點）,載體選擇pCAMBIA3301,酶切位點選擇Nco I和BstE II。載體確定已經(jīng)雙酶切開來，目的片段應(yīng)該也雙酶切成功（電泳圖片看不出來）。用的Promega的T4連接酶，載體和目的片段摩爾比1:5，反應(yīng)體系20ul，22℃連接3.5小時，轉(zhuǎn)化至DH5α，未出現(xiàn)菌落。 2、也有說將目的片段和T載體先連接，然后再和表達載體連接，這樣更容易連上。原理是什么，不懂。 感謝您的幫助。 |
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| 載體構(gòu)建連接不上，許多時候是載體片段和目的基因片段有問題，既然你給出了mol比例，說明你對于載體片段和目的基因片段的量是經(jīng)過測算的，因此問題可能出在酶切/連接環(huán)節(jié)。你的基因片段是否酶切開了呢？這個問題是與你的第二個問題相關(guān)的，之所以有人建議你先連接T載體，是因為PCR產(chǎn)物連接T載體效率相對較高（須用可在PCR產(chǎn)物末端可加A的PCR聚合酶），提取質(zhì)粒以后再用Nco I和BstE II酶切質(zhì)粒（此處為關(guān)鍵：酶切質(zhì)粒的效率一般要遠大于酶切PCR產(chǎn)物），回收帶粘末端的基因片段再與載體相連。不知你PCR引物設(shè)計時，酶切位點外側(cè)是否加了保護堿基呢？如果引物末端只加了酶切位點，而外側(cè)沒有加保護堿基，PCR產(chǎn)物是酶切不開的！也就不可能連接上，只能先連接T載體了。 |
7樓2014-04-13 02:27:30
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