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[求助]
目的片段和載體連接一直不上 已有7人參與
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1、目的片段738bp（兩端帶酶切位點(diǎn)）,載體選擇pCAMBIA3301,酶切位點(diǎn)選擇Nco I和BstE II。載體確定已經(jīng)雙酶切開(kāi)來(lái)，目的片段應(yīng)該也雙酶切成功（電泳圖片看不出來(lái)）。用的Promega的T4連接酶，載體和目的片段摩爾比1:5，反應(yīng)體系20ul，22℃連接3.5小時(shí)，轉(zhuǎn)化至DH5α，未出現(xiàn)菌落。 2、也有說(shuō)將目的片段和T載體先連接，然后再和表達(dá)載體連接，這樣更容易連上。原理是什么，不懂。 感謝您的幫助。 |
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8樓2014-04-14 14:04:01
for5
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-04-13 18:27:56
趙曉楠zxn: 金幣+2, ★★★很有幫助 2014-04-14 21:26:18
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沒(méi)長(zhǎng)菌算是壞事中的好事，至少?zèng)]有假陽(yáng)性，那就調(diào)整比例多連幾次吧。繼續(xù)轉(zhuǎn)。 T載體那是因?yàn)檫B接效率高，需要用taq酶進(jìn)行PCR，是目的基因兩端加A，但是同時(shí)質(zhì)量不好的T載體容易形成自連，也就導(dǎo)致假陽(yáng)性 |
2樓2014-04-12 20:57:42
Neo2000
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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3樓2014-04-12 22:46:37
淘淘279
銅蟲(chóng) (小有名氣)
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- 注冊(cè): 2013-09-22
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- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
4樓2014-04-12 23:06:33
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