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billtsu木蟲 (正式寫手)
木木
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[求助]
目的片段與載體連接后無法檢測出
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要做 互補實驗，需要的目的片段（2.8kb）用PCR擴增，雙酶切后T4連接酶連到載體pCT-Zori 上，轉(zhuǎn)入DH5α中，用Cm+Xgal+IPTG 的平板做藍白斑篩選，基本上的到的全部是白斑，選取白斑擴大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，進行PCR驗證，但是沒有目的片段的出現(xiàn)，雙酶切也沒有目的片段（條帶只有一條，載體的）。 實驗重復了好久了，結果都是這樣的 求各位大牛幫忙分析下，謝謝啦！ |
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billtsu
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3樓2012-08-10 18:25:34
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵積極熱心應助 2012-08-13 14:58:27
感謝參與，應助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵積極熱心應助 2012-08-13 14:58:27
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樓主，最后提取到質(zhì)粒沒有？ 我的意思是你提取質(zhì)粒后跑膠了沒有，可以取1微升跑個膠看下。 如果質(zhì)粒是提出來了的，可以用單、雙酶切同時鑒定. 單酶切可以知道酶切后分子量的大�。僭O為8000bp）,假設你的質(zhì)粒是6000bp，那么你的連接可能是成功的。 雙酶切，可以更準確的知道你的連接片段的長度，但是有時候雙酶切兩個酶的酶切溫度并不一致會造成酶切不充分或者其中之一的酶沒工作。 個人覺得用單雙酶切進行相互印證是比較可靠的。 此外，樓主在轉(zhuǎn)化的時候可以做2個對照，1.原來做過的成功的做一個陽性對照，2，陰性對照，可以用空載體。 最后，你的片段是否太大沒有連上，或者連接時間或溫度等不適合？此外，請再挑取單克隆后做菌落PCR來驗證是否克隆時正確的，同時用你的引物（連接片段中可設計特異引物）以及載體的通用引物（或者你自己根據(jù)載體設計也可以），同一個單菌落挑取后混勻到10微升水里，分別取1微升出來，用上述2對引物擴增來確定克隆正確與否。 |
4樓2012-08-10 21:49:52
billtsu
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5樓2012-08-12 09:52:46
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