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zhoubin0823木蟲 (小有名氣)
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[求助]
糾結(jié)的分子實(shí)驗(yàn)，雙酶切連不上，求助
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我用的表達(dá)載體是pMAL-c5X,選的酶切位點(diǎn)是NdeⅠ與NotⅠ，T載體用的是pMD19-T，目的基因片段2200左右，T載體與目的基因連上了，測(cè)序正確，分別將表達(dá)載體與連上目的基因的T載體雙酶切后，分別按載體：目的基因?yàn)?:7、2:6的比例連接，就是沒(méi)有長(zhǎng)菌，怎么回事？求高手解答。期間做過(guò)一些對(duì)照試驗(yàn)： 1：用未酶切的質(zhì)粒pMAL-c5X轉(zhuǎn)化感受態(tài)可以得到大量單菌落，以此排除感受態(tài)問(wèn)題。 2：分別用連接酶連接雙酶切的pMAL-c5x與連接目的基因的T載體，結(jié)果顯示不長(zhǎng)單菌落，以此排除酶切不充分。 3：實(shí)驗(yàn)室的連接酶其他同學(xué)成功連接過(guò)，也可以排除連接酶的問(wèn)題。 那么是因?yàn)槟康幕蚱翁�，難以連接嗎？求解答�。�！ |
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zhoulubin
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一、2.2kb的片段應(yīng)該不大，不知道pMAL-c5X載體多大，這個(gè)載體好像不是很常見(jiàn)吶。 二、”分別將表達(dá)載體與連上目的基因的T載體雙酶切后，分別按載體：目的基因?yàn)?:7、2:6的比例連接，就是沒(méi)有長(zhǎng)菌“，沒(méi)有載體圖，也不知道切下來(lái)的片段多大，我想你應(yīng)該知道根據(jù)不同大小去進(jìn)行膠回收純化或PCR產(chǎn)物純化吧。 三、連接的比例1:2~1:5是指摩爾比，要考慮片段大小的，這個(gè)建議參考TaKaRa pMD18、19T Vector 說(shuō)明書中算法。一般做得多的話，都是直接根據(jù)電泳條帶亮度做相應(yīng)調(diào)整。如果樣品濃度低，可以不加水，增大反應(yīng)體系。 四、一般片段較長(zhǎng)，連接時(shí)間相應(yīng)也較長(zhǎng)，不同公司的ligase給的參考條件不一樣，建議16℃過(guò)夜。 五、酶切時(shí)間按照說(shuō)明書來(lái)，不是時(shí)間越長(zhǎng)越好，有些酶長(zhǎng)時(shí)間incubator會(huì)有星活性。 最后，突然發(fā)現(xiàn)我們用戶名挺像 |
2樓2013-06-08 21:53:57
zhoubin0823
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你先把回收的片段跑膠看看確定濃度以及有沒(méi)有會(huì)受到，如果都沒(méi)問(wèn)題的話，我不知道你連接體系用的多大，我一般是10uL的連接體系，除了酶和buffer外其余全加連接片段，一般載體加1 uL，其余就是插入基因了。 實(shí)在不行，你問(wèn)問(wèn)你們實(shí)驗(yàn)室有沒(méi)有人用這個(gè)載體構(gòu)建出來(lái)過(guò)質(zhì)粒，有的話問(wèn)他要一點(diǎn)切一下做載體，這個(gè)能確保切得完全。 |
6樓2013-06-11 23:15:59
zhoubin0823
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7樓2013-06-13 10:10:13
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8樓2013-06-13 10:13:43
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10樓2013-06-13 14:28:37
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