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Mis_Q銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
（基因克�。╇p酶切結(jié)果與目的條帶大小不一致，求有經(jīng)驗的人幫幫我。 已有2人參與
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1. 目的條帶加酶切位點一共1200bp左右，酶切位點是Bgl II （Buffer 3.1）和Nhe I（Buffer 2.1），內(nèi)切酶是NEB公司的�？寺≥d體為TaKaRa 的 T-Vector pMD 19 ( Simple ), 載體長度為2692 bp。 2. 將目的產(chǎn)物連接到克隆載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (DH5α)，藍白斑篩選，挑取白色單個菌落后過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。 3. 對菌液和質(zhì)粒都進行PCR驗證，結(jié)果均出現(xiàn)目的條帶。  以上為質(zhì)粒PCR圖片 4. 檢測質(zhì)粒濃度后參考NEB提供體系先分別進行兩個酶的單酶切。 體系： 酶 1 μl ； DNA 1 μg； 10*NEBuffer 5 μl； 總體系 50 μl 反應(yīng)條件：37℃ 水浴過夜，Bgl II 加TaKaRa 6*Load Buffer終止反應(yīng)，Nhe I 65℃ 20min 使用PCR儀終止反應(yīng)。 單酶切結(jié)果： 瓊脂糖凝膠結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個酶均出現(xiàn)2000 bp左右片段，同時與質(zhì)粒一起跑膠，發(fā)現(xiàn)條帶比質(zhì)粒稍大一點。  5. 之前也試過分步雙酶切，先Bgl II 37℃過夜，然后瓊脂糖凝膠回收，再Nhe I 37℃過夜，結(jié)果凝膠結(jié)果完全沒有條帶，懷疑割膠回收損失太大。   6. 先進行Nhe I 酶切（50ul體系），然后吸出6ul，再加入Bgl II和Buffer 3.1共6ul，補足50ul后繼續(xù)酶切，這次仍然沒有出現(xiàn)目的大小片段。 37℃水浴過夜，pcr儀5h，都試過了，每次出來都是2000bp大小的條帶。因為第一次做酶切反應(yīng)，所以現(xiàn)在已經(jīng)完全不知道該怎么辦了，希望有經(jīng)驗的人來幫幫我看看是哪里出的問題，非常感謝！ 非常抱歉內(nèi)容寫的有點多  。 |
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Mis_Q
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