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fayzhao金蟲 (小有名氣)
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[求助]
雙酶切后目的條帶很淡，回收不到
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目前在做雙酶切，目的是從T載體上把目的片段切下來，目的片段513bp。 用的是fermentas的常規(guī)內(nèi)切酶，由于不能同時切，我選擇的是連續(xù)酶切，以下是具體酶切體系。 第一種方案，具體如下，標記為1： 20ul體系：dd水 12ul 10xTango 2ul 質(zhì)粒 5ul（約1ug） KpnI 1ul 37℃，5小時， 然后直接在管中再加入以下： 10xTango 2.5ul BglII 1ul 37℃，5小時 另一方案是從網(wǎng)上學的，具體如下，標記為2： 20ul體系：dd水 12ul 10xbuffer KpnI 2ul 質(zhì)粒 5ul（約1ug） KpnI 1ul 37℃，5小時， 然后直接在管中再加入以下： dd水 25ul 10xbuffer 0 6ul BglII 1ul 37℃，5小時 但是雙酶切之后，目的條帶很淡，由于第一天時間不足，因此將酶切產(chǎn)物放在4℃，第二天切膠回收時沒有回收到……請大家?guī)蛶兔Γ(∩_∩)O謝謝！ 圖片如下： 順序：質(zhì)粒，雙酶切1，雙酶切2，2000marker.jpg |
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| 首先，你需要明確你需要回收到多少小片段。如果只是一個簡單的亞克隆，那么你只要回收到200-300ng就足夠了（因為一般回收時洗脫體積為20ul，洗脫后回收片段濃度為10-15ng/ul），考慮到回收效率為50%，因而理論上酶切后你的小片段量應該至少600ng，再結合你的原始質(zhì)粒的大小，以及你的目的片段在原始載體中的比例，就可以計算出酶切時你需要的質(zhì)粒DNA量�？紤]到一般T載體的大小在3000bp左右，而你的目的片度為500bp，因而你至少需要酶切4ug左右的質(zhì)粒，才能回收到合適濃度的目的基因片段，你的酶切實驗只用了1ug質(zhì)粒，你很難回收到足夠量的目的基因片段。關于雙酶切的具體設計，我建議你利用一個專門進行雙酶切設計的軟件（double digestion designer）進行設計，該軟件不僅能夠精確計算酶切時需要的酶量，而且可以自動推薦合適的buffer.該軟件現(xiàn)在可以免費試用，你可以試試。該軟件的鏈接在小木蟲上可以搜到。 |
4樓2012-12-07 23:05:21
fayzhao
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7樓2012-12-10 16:03:35
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2樓2012-12-07 20:32:12
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我查了一下樓主用的兩個酶的buffer情況，的確他們不能共用buffer，且KpnI只能用KpnI buffer，樓主以上的兩種切法都是可以的，看那個膠第二泳道其實可以回收了，也足夠用于后續(xù)連接目標載體了，如果實在切不開的話。 這種情況，我把我的做法跟樓主分享下，我們實驗室有四個公司的內(nèi)切酶，分別有fermentas，takara，toyobo，NEB。我一般這是個公司的酶混用，但專一與NEB的buffer，長期實踐經(jīng)驗表明，混用酶在NEB buffer里不影響酶切效果，所以樓主要是用NEB buffer的話，還是可以找到雙酶切buffer的，可以在2+ BSA切 NEB雙酶切buffer這里找： http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp |
3樓2012-12-07 23:03:08
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