 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 4383 | 回復(fù): 15 | ||||
fayzhao金蟲(chóng) (小有名氣)
|
[求助]
雙酶切后目的條帶很淡，回收不到
|
|||
|
目前在做雙酶切，目的是從T載體上把目的片段切下來(lái)，目的片段513bp。 用的是fermentas的常規(guī)內(nèi)切酶，由于不能同時(shí)切，我選擇的是連續(xù)酶切，以下是具體酶切體系。 第一種方案，具體如下，標(biāo)記為1： 20ul體系：dd水 12ul 10xTango 2ul 質(zhì)粒 5ul（約1ug） KpnI 1ul 37℃，5小時(shí)， 然后直接在管中再加入以下： 10xTango 2.5ul BglII 1ul 37℃，5小時(shí) 另一方案是從網(wǎng)上學(xué)的，具體如下，標(biāo)記為2： 20ul體系：dd水 12ul 10xbuffer KpnI 2ul 質(zhì)粒 5ul（約1ug） KpnI 1ul 37℃，5小時(shí)， 然后直接在管中再加入以下： dd水 25ul 10xbuffer 0 6ul BglII 1ul 37℃，5小時(shí) 但是雙酶切之后，目的條帶很淡，由于第一天時(shí)間不足，因此將酶切產(chǎn)物放在4℃，第二天切膠回收時(shí)沒(méi)有回收到……請(qǐng)大家?guī)蛶兔�！O(∩_∩)O謝謝！ 圖片如下： 順序：質(zhì)粒，雙酶切1，雙酶切2，2000marker.jpg |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有157人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線(xiàn)
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專(zhuān)業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 目的基因片段膠回收后酶切，然后再跑膠后發(fā)現(xiàn)條帶很弱，怎么改進(jìn)（求助）
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 雙酶切沒(méi)有切開(kāi)，怎么回事啊
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 雙酶切后目的片段變大
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 做雙酶切 跑膠后什么都沒(méi)有 是怎么回事？
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 雙酶切后目的條帶的疑問(wèn)？
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 雙酶切后載體片段變小
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 求助關(guān)于雙酶切空載跑膠沒(méi)有條帶！
已經(jīng)有15人回復(fù)
- PET-32a雙酶切無(wú)法回收
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 雙酶切，切不下來(lái)
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 質(zhì)粒PCR大小正確，可是雙酶切切不開(kāi)
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 雙酶切看不到小片段，為什么？
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 十萬(wàn)火急，重組質(zhì)粒酶切只有一條帶，測(cè)序有結(jié)果，但反復(fù)說(shuō)我質(zhì)粒濃度很低
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 雙酶切的片段不見(jiàn)了？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 雙酶切切出了5條條帶
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【問(wèn)題反饋】質(zhì)粒雙酶切切下120bp每次都看不到？
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 雙酶切后目的條帶下出現(xiàn)多個(gè)條帶的原因
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】雙酶切質(zhì)粒后，目的條帶淺且前方有模糊亮帶
已經(jīng)有12人回復(fù)
酶切專(zhuān)家
金蟲(chóng) (小有名氣)
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 96 (初中生)
- 金幣: 1610.8
- 紅花: 4
- 帖子: 149
- 在線(xiàn): 41.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1648414
- 注冊(cè): 2012-02-27
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
fayzhao: 金幣+2, ★★★很有幫助, 非常感謝！ 2012-12-08 09:14:41
amisking: 回帖置頂 2012-12-08 18:55:14
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
fayzhao: 金幣+2, ★★★很有幫助, 非常感謝！ 2012-12-08 09:14:41
amisking: 回帖置頂 2012-12-08 18:55:14
| 首先，你需要明確你需要回收到多少小片段。如果只是一個(gè)簡(jiǎn)單的亞克隆，那么你只要回收到200-300ng就足夠了（因?yàn)橐话慊厥諘r(shí)洗脫體積為20ul，洗脫后回收片段濃度為10-15ng/ul），考慮到回收效率為50%，因而理論上酶切后你的小片段量應(yīng)該至少600ng，再結(jié)合你的原始質(zhì)粒的大小，以及你的目的片段在原始載體中的比例，就可以計(jì)算出酶切時(shí)你需要的質(zhì)粒DNA量�？紤]到一般T載體的大小在3000bp左右，而你的目的片度為500bp，因而你至少需要酶切4ug左右的質(zhì)粒，才能回收到合適濃度的目的基因片段，你的酶切實(shí)驗(yàn)只用了1ug質(zhì)粒，你很難回收到足夠量的目的基因片段。關(guān)于雙酶切的具體設(shè)計(jì)，我建議你利用一個(gè)專(zhuān)門(mén)進(jìn)行雙酶切設(shè)計(jì)的軟件（double digestion designer）進(jìn)行設(shè)計(jì)，該軟件不僅能夠精確計(jì)算酶切時(shí)需要的酶量，而且可以自動(dòng)推薦合適的buffer.該軟件現(xiàn)在可以免費(fèi)試用，你可以試試。該軟件的鏈接在小木蟲(chóng)上可以搜到。 |
4樓2012-12-07 23:05:21
fayzhao
金蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 809.6
- 帖子: 97
- 在線(xiàn): 106.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1573744
- 注冊(cè): 2012-01-11
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
2樓2012-12-07 20:32:12
gyesang
榮譽(yù)版主 (著名寫(xiě)手)
-
專(zhuān)家經(jīng)驗(yàn): +24 - MolEPI: 31
- 應(yīng)助: 599 (博士)
- 貴賓: 2.689
- 金幣: 24334.9
- 散金: 1088
- 紅花: 88
- 沙發(fā): 2
- 帖子: 2327
- 在線(xiàn): 623.1小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 849017
- 注冊(cè): 2009-09-16
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
- 管轄: 分子生物
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
fayzhao: 金幣+2, ★★★很有幫助, 非常感謝！ 2012-12-08 09:11:44
amisking: 金幣+3, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流問(wèn)題。 2012-12-08 18:55:09
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
fayzhao: 金幣+2, ★★★很有幫助, 非常感謝！ 2012-12-08 09:11:44
amisking: 金幣+3, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流問(wèn)題。 2012-12-08 18:55:09
|
我查了一下樓主用的兩個(gè)酶的buffer情況，的確他們不能共用buffer，且KpnI只能用KpnI buffer，樓主以上的兩種切法都是可以的，看那個(gè)膠第二泳道其實(shí)可以回收了，也足夠用于后續(xù)連接目標(biāo)載體了，如果實(shí)在切不開(kāi)的話(huà)。 這種情況，我把我的做法跟樓主分享下，我們實(shí)驗(yàn)室有四個(gè)公司的內(nèi)切酶，分別有fermentas，takara，toyobo，NEB。我一般這是個(gè)公司的酶混用，但專(zhuān)一與NEB的buffer，長(zhǎng)期實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，混用酶在NEB buffer里不影響酶切效果，所以樓主要是用NEB buffer的話(huà)，還是可以找到雙酶切buffer的，可以在2+ BSA切 NEB雙酶切buffer這里找： http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp |
3樓2012-12-07 23:03:08
fayzhao
金蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 809.6
- 帖子: 97
- 在線(xiàn): 106.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1573744
- 注冊(cè): 2012-01-11
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
5樓2012-12-08 09:13:28
fayzhao
金蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 809.6
- 帖子: 97
- 在線(xiàn): 106.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1573744
- 注冊(cè): 2012-01-11
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
6樓2012-12-08 09:15:49
fayzhao
金蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 809.6
- 帖子: 97
- 在線(xiàn): 106.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1573744
- 注冊(cè): 2012-01-11
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
7樓2012-12-10 16:03:35
platanus
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 36 (小學(xué)生)
- 金幣: 4570.3
- 散金: 113
- 紅花: 2
- 帖子: 1261
- 在線(xiàn): 152小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 439482
- 注冊(cè): 2007-10-13
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 觀賞園藝學(xué)
8樓2012-12-10 17:21:39
fayzhao
金蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 809.6
- 帖子: 97
- 在線(xiàn): 106.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1573744
- 注冊(cè): 2012-01-11
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
9樓2012-12-10 18:06:59
lillian菲
銀蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 22 (小學(xué)生)
- 金幣: 1474.2
- 紅花: 3
- 帖子: 74
- 在線(xiàn): 29.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1642017
- 注冊(cè): 2012-02-25
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 生物化學(xué)
10樓2012-12-10 18:16:05
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 fayzhao 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿重慶大學(xué)085700資源與環(huán)境總分308求調(diào)劑 +6 | 墨墨漠 2026-03-20 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +5 | 睿08 2026-03-17 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料 336 求調(diào)劑 +3 | An@. 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
[考研] 324分 085600材料化工求調(diào)劑 +4 | llllkkkhh 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑求學(xué)校推薦 +3 | 伯樂(lè)29 2026-03-18 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 317求調(diào)劑 +5 | 申子申申 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 295材料求調(diào)劑，一志愿武漢理工085601專(zhuān)碩 +5 | Charlieyq 2026-03-19 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料與化工專(zhuān)碩調(diào)劑 +7 | heming3743 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)]
學(xué)校已經(jīng)提交到NSFC，還能修改嗎？
 40+4
|
babangida 2026-03-19 | 8/400 |
|
|
|
[考研]
 320求調(diào)劑0856
+3
|
不想起名字112 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 266求調(diào)劑 +5 | 陽(yáng)陽(yáng)哇塞 2026-03-14 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 材料與化工求調(diào)劑 +7 | 為學(xué)666 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工求調(diào)劑 +6 | 緒幸與子 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料，紡織，生物（0856、0710），化學(xué)招生啦 +3 | Eember. 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)336分求調(diào)劑 +6 | zbzihdhd 2026-03-15 | 7/350 |
|
|
|
[碩博家園] 湖北工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與健康學(xué)院-課題組招收2026級(jí)食品/生物方向碩士 +3 | 1喜春8 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 有沒(méi)有道鐵/土木的想調(diào)劑南林，給自己招師弟中～ +3 | TqlXswl 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +4 | 太陽(yáng)花天天開(kāi)心 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿，福州大學(xué)材料專(zhuān)碩339分求調(diào)劑 +3 | 木子momo青爭(zhēng) 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 070303 總分349求調(diào)劑 +3 | LJY9966 2026-03-15 | 5/250 |
|