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大臉貓貓喵金蟲 (初入文壇)
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[求助]
NdeI,BamHI雙酶切
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| 我用NedI和BamHI雙酶切我的目的片段然后和28a連接。試著改變了多次酶切酶連條件，但一直都轉(zhuǎn)化不出來。28a切完后跑電泳與質(zhì)粒比較應(yīng)該是切開的�，F(xiàn)在不知道問題到底是出在哪里了。求各位幫忙分析一下，可能的原因以及解決的方案吧~謝謝~~感激不盡！ |
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cookee1981
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gyesang: 很好的建議，樓主可以考慮 2013-08-15 16:53:39
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gyesang: 很好的建議，樓主可以考慮 2013-08-15 16:53:39
| 你的目的片段是PCR產(chǎn)物還是已經(jīng)連在了克隆載體上？如果是直接用PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，可能會比較困難，而且要看你有沒有在酶切位點兩端加上保護(hù)堿基。如果是從克隆載體上雙酶切，那就要測序檢查一下酶切位點是否為唯一的在目的片段兩端。 |
4樓2013-08-15 14:48:07
gyesang
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2樓2013-08-14 18:06:44
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3樓2013-08-15 13:35:40
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5樓2013-08-15 14:54:53
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6樓2013-08-15 15:33:42
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7樓2013-08-15 15:39:22
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1、用通用緩沖液進(jìn)行雙酶切，酶量不可太多，例如2~3mL培養(yǎng)過夜菌體，Kit提取質(zhì)粒用40uLDDW洗脫下來，可加NdeI 2~3U，BamHI 1~2U,混勻后37℃，酶切1.5h即可，酶量不能太多，酶切時間不宜太長； 2、膠回收不要用低熔點瓊脂糖，譬如用Agarose H，膠濃度用0.5%，膠長度~15~20cm(可將常用的兩灌膠槽用膠帶串接在一起)，準(zhǔn)備冷凍的電極緩沖液中間更換緩沖液，或凍制緩沖冰塊，中間加入冷卻，電壓用120~140V，電泳時間~1.5-2.5h,注意除了電Marker樣品外，還帶上未酶切的載體樣作對比； 3、用常規(guī)膠回收試劑盒回收，熔膠穩(wěn)定控制在50℃左右，6~10mins，柱中目標(biāo)片段用30uL水洗脫下來，一定要電泳檢視，取3~5ul點樣，應(yīng)該條帶清晰，無降解和聚集等雜帶； 4、待插入的雙酶切目標(biāo)基因按常規(guī)操作，最后回收樣也要電泳檢視質(zhì)量可靠后，再與載體連接。 |
8樓2018-11-19 09:52:27
hxd2002
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1.如果你有含插入基因（最好大于1kb，愈大更好）的pET類載體，還可再用NdeI/BamHI雙切則比較方便，直接用NdeI/BamHI雙切，低濃度加長膠電泳可回收到酶切好的高質(zhì)量的pET-NdeI/BamHI備用載體；若只有原始載體，因為NdeI或BamHI均不能保證100%切開，特別NdeI大致只有70%，因此你雙酶切的載體中大致有30%的載體僅僅是完成單切，因此你的載體再連接時，相當(dāng)于連接液中原始載體特別高，而目的連接載體不多，需要篩選比較多的克隆才可能篩選到你的目標(biāo)克��； 2.其次，由于插入用載體質(zhì)量差，連接時還是按連接說明書中載體/基因=1:5的比例，那么合格的連接所占比例就非常低，轉(zhuǎn)化篩選自然困難；此時可用可用1:1或2:1比例； 3.NdeI的保護(hù)堿基比較特別，可在百度中輸入“限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基”，可查找到有關(guān)保護(hù)堿基設(shè)計的文章參考，不然你的插入基因根本就沒有NdeI粘端，自然連接轉(zhuǎn)化不成功； 4.感受態(tài)質(zhì)量可通過平行用未酶切的載體作為對照，應(yīng)該長出很多陽性克隆，若對照都沒長，自然表明感受態(tài)不好； 5.電轉(zhuǎn)化時，由于多數(shù)時候用的都是反復(fù)使用的舊電轉(zhuǎn)杯，而電極鋁片氧化嚴(yán)重，再按常規(guī)電轉(zhuǎn)參數(shù)自然效率不高，可用細(xì)砂紙打磨下電極除掉氧化層，外側(cè)方便打磨，內(nèi)側(cè)可將砂紙裁成小條，用硬薄片物頂住輕輕打磨好，再用DDW沖洗干凈，超凈工作臺內(nèi)紫外燈照射并吹干后再用。 6.若你的實驗室不差錢，對于用pET原始載體進(jìn)行雙酶切的操作可再酶切1.5h后加入堿性磷酸酶（如FastAP）進(jìn)行脫磷酸處理，65℃滅活后再膠回收，連接時比例用載體/基因=1:1比例連接，再轉(zhuǎn)化。 祝你實驗順利！ |
9樓2018-11-19 10:21:04
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