 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 4337 | 回復(fù): 8 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
大臉貓貓喵金蟲 (初入文壇)
|
[求助]
NdeI,BamHI雙酶切
|
||
| 我用NedI和BamHI雙酶切我的目的片段然后和28a連接。試著改變了多次酶切酶連條件，但一直都轉(zhuǎn)化不出來。28a切完后跑電泳與質(zhì)粒比較應(yīng)該是切開的�，F(xiàn)在不知道問題到底是出在哪里了。求各位幫忙分析一下，可能的原因以及解決的方案吧~謝謝~~感激不盡！ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有277人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 關(guān)于雙酶切作用時(shí)間
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 載體上臨近的兩個(gè)酶切位點(diǎn)可以設(shè)計(jì)起來做雙酶切嗎？
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 有關(guān)NEB內(nèi)切酶NdeI和XhoI的雙酶切問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 重組質(zhì)粒單雙酶切結(jié)果一樣，奇怪了的……
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 雙酶切沒有切開，怎么回事啊
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 關(guān)于分步雙酶切
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 目的片段中含有酶切位點(diǎn)，求解決方案
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 雙酶切后載體片段變小
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 求助關(guān)于雙酶切空載跑膠沒有條帶！
已經(jīng)有15人回復(fù)
- Hind111 與 Not1雙酶切請教 急急急�。�！
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 雙酶切看不到小片段，為什么？
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 關(guān)于EcoRI的部分酶切
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 表達(dá)載體雙酶切
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 雙酶切，體系，切不出來
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 重組質(zhì)粒雙酶切問題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- HindIII酶切基因組DNA
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 雙酶切體系是什么意思
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 求助！請問 NdeI 和EcoRI 同時(shí)做酶切可以嗎？
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 【求助/交流】BamHI酶切
已經(jīng)有27人回復(fù)
- 【求助/交流】怎樣才能把HINDIII marker跑好
已經(jīng)有7人回復(fù)
hxd2002
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 0.5
- 帖子: 3
- 在線: 43分鐘
- 蟲號(hào): 1877321
- 注冊: 2012-07-03
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學(xué)
|
1.如果你有含插入基因（最好大于1kb，愈大更好）的pET類載體，還可再用NdeI/BamHI雙切則比較方便，直接用NdeI/BamHI雙切，低濃度加長膠電泳可回收到酶切好的高質(zhì)量的pET-NdeI/BamHI備用載體；若只有原始載體，因?yàn)镹deI或BamHI均不能保證100%切開，特別NdeI大致只有70%，因此你雙酶切的載體中大致有30%的載體僅僅是完成單切，因此你的載體再連接時(shí)，相當(dāng)于連接液中原始載體特別高，而目的連接載體不多，需要篩選比較多的克隆才可能篩選到你的目標(biāo)克�。� 2.其次，由于插入用載體質(zhì)量差，連接時(shí)還是按連接說明書中載體/基因=1:5的比例，那么合格的連接所占比例就非常低，轉(zhuǎn)化篩選自然困難；此時(shí)可用可用1:1或2:1比例； 3.NdeI的保護(hù)堿基比較特別，可在百度中輸入“限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基”，可查找到有關(guān)保護(hù)堿基設(shè)計(jì)的文章參考，不然你的插入基因根本就沒有NdeI粘端，自然連接轉(zhuǎn)化不成功； 4.感受態(tài)質(zhì)量可通過平行用未酶切的載體作為對照，應(yīng)該長出很多陽性克隆，若對照都沒長，自然表明感受態(tài)不好； 5.電轉(zhuǎn)化時(shí)，由于多數(shù)時(shí)候用的都是反復(fù)使用的舊電轉(zhuǎn)杯，而電極鋁片氧化嚴(yán)重，再按常規(guī)電轉(zhuǎn)參數(shù)自然效率不高，可用細(xì)砂紙打磨下電極除掉氧化層，外側(cè)方便打磨，內(nèi)側(cè)可將砂紙裁成小條，用硬薄片物頂住輕輕打磨好，再用DDW沖洗干凈，超凈工作臺(tái)內(nèi)紫外燈照射并吹干后再用。 6.若你的實(shí)驗(yàn)室不差錢，對于用pET原始載體進(jìn)行雙酶切的操作可再酶切1.5h后加入堿性磷酸酶（如FastAP）進(jìn)行脫磷酸處理，65℃滅活后再膠回收，連接時(shí)比例用載體/基因=1:1比例連接，再轉(zhuǎn)化。 祝你實(shí)驗(yàn)順利！ |
9樓2018-11-19 10:21:04
gyesang
榮譽(yù)版主 (著名寫手)
-
專家經(jīng)驗(yàn): +24 - MolEPI: 31
- 應(yīng)助: 599 (博士)
- 貴賓: 2.689
- 金幣: 24334.9
- 散金: 1088
- 紅花: 88
- 沙發(fā): 2
- 帖子: 2327
- 在線: 623.1小時(shí)
- 蟲號(hào): 849017
- 注冊: 2009-09-16
- 性別: GG
- 專業(yè): 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
- 管轄: 分子生物
2樓2013-08-14 18:06:44
hermain
木蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 1765.5
- 帖子: 97
- 在線: 307.4小時(shí)
- 蟲號(hào): 1418365
- 注冊: 2011-09-26
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
3樓2013-08-15 13:35:40
cookee1981
銀蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 236.4
- 帖子: 46
- 在線: 30.2小時(shí)
- 蟲號(hào): 1677731
- 注冊: 2012-03-09
- 專業(yè): 作物分子育種
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-08-15 16:47:25
gyesang: 回帖置頂 2013-08-15 16:47:37
gyesang: 很好的建議，樓主可以考慮 2013-08-15 16:53:39
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-08-15 16:47:25
gyesang: 回帖置頂 2013-08-15 16:47:37
gyesang: 很好的建議，樓主可以考慮 2013-08-15 16:53:39
| 你的目的片段是PCR產(chǎn)物還是已經(jīng)連在了克隆載體上？如果是直接用PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，可能會(huì)比較困難，而且要看你有沒有在酶切位點(diǎn)兩端加上保護(hù)堿基。如果是從克隆載體上雙酶切，那就要測序檢查一下酶切位點(diǎn)是否為唯一的在目的片段兩端。 |
4樓2013-08-15 14:48:07
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料學(xué)學(xué)碩080502 337求調(diào)劑-一志愿華中科技大學(xué) +3 | 順順順mr 2026-03-18 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +3 | wyyyqx 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +5 | 睿08 2026-03-17 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 324分 085600材料化工求調(diào)劑 +4 | llllkkkhh 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿華中科技大學(xué)，080502，354分求調(diào)劑 +5 | 守候夕陽CF 2026-03-18 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿重慶大學(xué)085700資源與環(huán)境專碩，總分308求調(diào)劑 +3 | 墨墨漠 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 南京大學(xué)化學(xué)376求調(diào)劑 +3 | hisfailed 2026-03-19 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 295求調(diào)劑 +4 | 一志愿京區(qū)211 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑，一志愿:南京航空航天大學(xué)大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩，總分289分 +4 | @taotao 2026-03-19 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 藥學(xué)383 求調(diào)劑 +3 | 藥學(xué)chy 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 353求調(diào)劑 +3 | 拉鉤不許變 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿吉林大學(xué)材料學(xué)碩321求調(diào)劑 +11 | Ymlll 2026-03-18 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑（0805） +14 | 煙汐憶海 2026-03-16 | 25/1250 |
|
|
|
[考研] 286分人工智能專業(yè)請求調(diào)劑愿意跨考！ +3 | lemonzzn 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 能源材料化學(xué)課題組招收碩士研究生8-10名 +5 | 脫穎而出 2026-03-16 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +10 | 妮妮ninicgb 2026-03-15 | 14/700 |
|
|
|
[考博] 申博26年 +3 | 八6八68 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +5 | pupcoco 2026-03-17 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 材料工程專碩調(diào)劑 +5 | 204818@lcx 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 生物學(xué)071000 329分求調(diào)劑 +3 | 我愛生物生物愛?/a> 2026-03-17 | 3/150 |
|